【摘要】 目的 研究雌、孕激素对人卵巢癌细胞株HO8910细胞增值、凋亡的影响，从而为临床采用孕激素辅助治疗卵巢癌提供依据。方法 体外培养卵巢癌细胞，分为孕激素、雌激素用药组，MTT比色法观察对细胞增殖的影响，流式细胞仪观察对细胞凋亡率的影响。结果 随着孕激素浓度的增加，对卵巢癌细胞增值的抑制作用明显增强，而且细胞的凋亡率升高，而雌激素组药物对细胞凋亡及增殖无明显作用。结论 孕激素能够抑制卵巢癌细胞的增殖，并能够诱导细胞凋亡，雌激素对细胞增殖及凋亡无明确作用。
【关键词】 卵巢癌;雌激素;孕激素;凋亡
Impact of Estrogen and Progesterone on Proliferation and Apoptosis of Ovarian CancerLI Ying，WANG Hu(Central Hospital of Jinzhou， Jinzhou 121001 China)Abstract: Objective to investigate the impact of Estrogen and Progesterone on Proliferation and Apoptosis of Ovarian cancer line HO8910. Methods The groups consisted of deferent concentration of progesterone and estrogen group. Apoptotic percentage was detected by flow Cytometry. The proliferation of ovarian cancer cell was determined by methyl thiazolyl tetrazoliurm (MTT) Results With the increasing of progesterone concentration， progesterone inhibited the growth of ovarian cancer cells significantly. But estrogen has no significant effect on the growth of ovarian cancer cells. Conclusions Progesterone can inhibit the growth of ovarian cancer cells and induce apoptosis. Estrogen doesnt have such influence.
Key words:ovarian cancer; estrogen; progesterone; apoptosis
卵巢不仅产生甾体激素，而且卵巢本身也是多种激素的靶器官，卵巢癌的发生与性腺内分泌失调有着密切的关系，在使用雌激素和孕激素替代治疗的绝经妇女中，发现孕激素能够降低卵巢癌发生的危险。并且长期口服避孕药的人患卵巢癌风险明显降低。孕激素抗卵巢癌作用机理还不明确，而雌激素对卵巢癌细胞的作用结果更是多样化。
1 材料与方法
1.1 材料 人卵巢癌细胞株HO8910来自人卵巢浆液性囊腺癌细胞，购于南京凯基生物制品有限公司;雌、孕激素购自美国Sigma公司产品;四甲基偶氮唑兰(MTT)及二甲基亚砜(DMSO)，购自AMRESCO公司;Annexin V-FITc凋亡检测试剂盒，购于南京凯基生物制品有限公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养及分组 常规卵巢癌细胞体外培养法培养卵巢癌细胞株HO8910，取对数生长期细胞进行实验。试验共分7 组，对照组：不含药物;治疗组按不同浓度雌、孕激素各分为：10-5 mol/L组，10-6 mol/L组，10-7 mol/L组。
1.2.2 细胞增殖试验 以每孔4 000个细胞接种到96 孔板，在恒温培养箱内培养24 小时，换培养液，对照组加入完全培养基，实验组加入已稀释好的不同浓度的药物，恒温培养箱内培养72 小时，每孔加入50 μL MTT(C=1 mg/mL)，继续培养4小时后，倒掉培养基，每孔加入150 μL DMSO溶液，用酶标仪测波长为490 nm时的吸光度(OD值)。计算不同浓度雌、孕激素对细胞增值的抑制率，【抑制率=(对照组OD均值—试验组OD均值)/对照组OD均值】，实验重复3次。
1.2.3 倒置显微镜下细胞形态学观察
1.2.4 细胞凋亡率的测定 培养所得细胞接种于6孔培养板，试验组加入药物，雌、孕激素终浓度均为：10-5 mol/L，10-6 mol/L，对照组加无药物培养基，培养72小时后，收集细胞，用200 μL 的Binding Buffer 悬浮细胞，加入10 μL Annexin V-FITc混匀后加入5 μL Propidium Iodide，然后混匀，避光室温反应15 分钟，加入300 μL Binding Buffer，流式细胞仪分析，检测细胞凋亡的情况(Ex=488 nm，Em=530 nm)。
1.3 统计学方法
应用SPSS统计软件11.5进行单因素方差分析及q检验，P&<0.05具有统计学意义。
2 结 果
2.1 细胞形态学观察
卵巢癌细胞株HO8910为上皮起源细胞，显微镜下可见处于对数生长期的细胞生长状态良好，细胞形态为多边形，细胞排列无规则，失去正常细胞的接触性抑制，细胞核异形，大小不一，成多形性，核仁清晰，不规则膨大核增多。孕激素实验组培养24 小时细胞数目略减少，形态无明显变化，随时间推移，细胞浆内出现空泡，培养至72 小时，细胞明显皱缩，体积变小，细胞间隙增大，细胞连接松开，培养液内可见细胞悬浮，部分细胞可见碎裂的细胞核，而胞浆完整，但不能识别细胞死亡或者凋亡。而雌激素组培养72 小时后细胞形态与加药前无明显区别。
2.2 MTT比色法观察结果显示
孕激素能抑制卵巢癌细胞增殖，并存在剂量依赖关系，随着孕激素浓度的增加，其对细胞增殖的抑制作用越明显(表1)，而雌激素各浓度组对细胞增殖作用无明显影响(表2)。
2.3 流式细胞仪检测结果显示
孕激素能诱导卵巢癌细胞凋亡，并且存在剂量依赖关系，不同浓度孕激素作用肿瘤细胞72 小时后，随着孕激素浓度的增加，凋亡率逐渐上升。而雌激素组各浓度显示对肿瘤细胞凋亡无作用(表3)。表1 孕激素实验组和对照组卵巢癌细胞吸光度值和增值抑制率注：与对照组相比★P&<0.01;实验组间两两比较△P&<0.01表2 雌激素实验组和对照组卵巢癌细胞吸光度值和增殖抑制率表3 雌、孕激素对卵巢肿瘤细胞凋亡率的影响 组别细胞凋亡率(%)孕激素组雌激素组实验组注：孕激素组：与对照组相比★P&<0.01;实验组内两两组比较△P&<0.01
雌激素组：各浓度组与对照组无差别P&>0.05
3 讨 论
雌激素是一个重要的体内激素，它对卵巢癌细胞体内、外生长影响的有关研究仍存在许多矛盾的结果。Langdon等[1]在对雌激素受体阳性的细胞株研究显示，10-12 mol/L雌二醇可刺激生长，以10-10 mol/L作用最强，当浓度&>10-6 mol/L时则表现抑制生长现象。部分学者认为雌激素对卵巢癌细胞的作用可能与细胞本身的雌激素受体含量有关，雌激素可使雌激素受体中度至重度表达的卵巢癌细胞增殖[2]，而对雌激素受体低表达或无表达的细胞则无增殖效应。已证实卵巢癌细胞株HO8910细胞含有雌激素受体和孕激素受体，提示可能为性激素依赖性细胞。陈红等人[3]的实验中表明10-12 mol/L浓度的雌二醇对HO8910细胞有促进作用，而在10-9～10-5 mol/L浓度间雌二醇对卵巢癌细胞生长无影响。本次试验结果表明雌激素在10-7～10-5 mol/L浓度间对卵巢癌细胞生长影响不大，这与陈红等人的实验结果一致，认为雌激素对卵巢癌细胞作用可能与剂量有关，同时与细胞的病理分型及激素受体表达的质和量有关。
对于孕激素对卵巢细胞生长的影响，各方面的研究比较一致，Rendina等[4]用大剂量醋酸甲孕酮治疗33 例晚期卵巢子宫内膜样癌，18 例(55%)有效。有研究发现，孕激素有明显的减轻腹水的作用，与细胞毒素药物联合应用疗效提高，客观缓解率可高达69%～80%[5]。孕激素抗癌作用的机理尚不十分清楚，认为孕激素进入细胞核内，可直接与受体结合，激活的受体促使细胞合成各种特异蛋白质，从而使卵巢癌细胞生长受到抑制[6]。我们通过体外实验证实孕激素能够有效抑制卵巢癌细胞生长，并呈剂量依赖性，而且实验表明孕激素能够促进卵巢癌细胞凋亡(P&<0.01)。因此，孕激素诱导肿瘤凋亡，可能是其抑制肿瘤细胞生长的重要机制之一。正是因为孕激素的这种抗卵巢癌作用日趋明显，对卵巢癌中孕激素受体的研究也显得尤为重要。
卵巢癌孕激素治疗的药物可能作用机理[7]：(1)利用抗雌激素类药物或无雌激素作用的类似物竞争结合雌激素受体，降低肿瘤对此激素的依赖;(2)应用孕激素类药物与孕激素受体结合发挥较强的抗雌激素作用;(3)大剂量的性激素不与受体结合而进入细胞，达到药理剂量则可产生细胞毒作用，杀灭肿瘤细胞。对于这些可能的作用机理，尚需要对细胞表面受体做定量检测实验，并且需要大样本的检验分析，在试验中采用细胞凋亡的生物化学检测、免疫化学检测及更深度的基因学研究，更能深刻地阐明雌、孕激素与卵巢肿瘤之间的相互关系。
参考文献
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[2] Langdon SP， Hirst GL， Miller EP， et al.Tregulation of grouth and protein expression by estrogen in vitro : a tudu of 8 human ovarian carcinoma cell line[J]. J Steroid Biochen Mol Biol， 1994， 50(3): 131.
[3] 陈红，胡琢英，邓小谷. 雌激素孕激素及促性腺激素对卵巢癌细胞株HO8910体外生长的调控[J]. 中山医科大学学报， 2001， 22(1): 29-32.
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[5] Whittemore AS， Harris R， Intyre J， et al. Characteristics relating to ovarian cancer risk， collaborative analysis of 12 us case-comtrol studies[J]. Am J Epidemiol， 1992， 136(10): 1175.
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[7] 范嫏娣. 卵巢临床与病理[M].天津:天津科学技术出版社，1993：128-130.