【摘要】 目的 观察Bcl-2在牙周病的发生发展的变化中的敏感程度，观察牙周塞治剂是否能加强盐酸米诺环素软膏治疗牙周病的效果。方法 选40 只日本大耳白兔，其中4 只作为对照组，其余36 只日本大耳白兔随机分为牙周炎未治疗组(牙周炎组12 只)、牙周炎应用盐酸米诺环素软膏组(派丽奥组12 只)，牙周炎应用盐酸米诺环素软膏和牙周塞治剂组(塞治剂12 只)。检测Bcl-2在牙龈组织中的表达及各组牙周病的指标比较。结果 应用盐酸米诺环素软膏合用牙周塞治剂后，牙周袋深度(PD)、龈沟出血指数(SBI)明显降低(P&<0.05)，Bcl-2在牙龈组织中的表达明显升高(P&<0.05)。结论 牙周塞治剂能明显提高派丽奥治疗兔牙周炎的效果，Bcl-2是牙周炎的敏感指标。
【关键词】 Bcl-2;牙周塞治剂;盐酸米诺环素软膏
Abstract:objective To observe the sensitivity of Bcl-2 in the periodontal disease and to observe if the periodontal pack can improve the healing effect of minocycline hydrochloride. Methods There are forty rabbits. Four rabbits were ready to set up as control group. Thirty-six rabbits were randomly assigned into 3 groups (n=12 each)， no treated periodontal disease group， minocycline hydrochloride to heal periodontal disease， minocycline hydrochloride combine with periodontal pack to heal periodontal disease. All rabbits were taken to measure the expression of Bcl-2 and periodontal index. Results After minocycline hydrochloride combine with periodontal pack to heal periodontal disease the index of probing depth and sulcus bledding are obviously drop. The expression of the Bcl-2 in gum is obviously elevate(P&<0.05). Conclusions Periodontal pack can obviously improve the effective of minocyclin hydrochloride; Bcl-2 is a sensitive index of periodontitis.
Key words:Bcl-2; periodontal pack; minocycline hydrochloride
细胞凋亡即程序性细胞死亡，是细胞在一定生理或病理条件下，由特定的信号分子启动，由基因调控的主动而有序的自我消亡过程[1]。细胞凋亡的调控是一种复杂的多水平的调控，多因素相互作用促进或抑制凋亡的发生。线粒体在细胞凋亡中也起着中心调控作用，在某种意义上，线粒体可以决定细胞的生存或死亡[2，3]。大量研究提示细胞凋亡参与牙周炎的发生、发展过程。本研究将通过对盐酸米诺环素软膏联合牙周塞治剂治疗兔牙周炎中各组牙龈组织中细胞凋亡抑制基因Bcl-2的表达、PD和SBI的改变，探讨牙周塞治剂对盐酸米诺环素软膏的治疗效果的影响。
1 材料和方法
1.1 实验材料
日本大耳白兔，雌雄各半， 3～6月龄，2～2.5 kg(辽宁医学院动物实验中心提供);盐酸米诺环素软膏(株式会社，日本);牙周塞治剂(VOCO公司，德国);Bcl-2(武汉博士德，中国)。
1.2 方法
1.2.1 兔牙周炎模型的制备和分组
日本大耳白兔40 只，普通饮食饲养15 天后分为4 组，对照组(正常饮食)4 只，实验组36 只。对照组全实验过程均饲以普通饮食。实验组采用植入牙结石的方法诱导牙周炎。局部麻醉下分离兔2个上前牙唇侧的牙龈，使之形成1 cm左右的牙周袋。然后植入备用的牙结石(选择临床上1 个月内局部及全身未服用抗生素的牙周炎患者的牙石放入肉汤管内，置37 ℃恒温箱中24 h后使用)，每周放1 次[4]。2-0丝线绑在龈下点与釉牙骨质之间，以促进牙菌斑牙龈积累[5]。并给予100 g/L的糖水饲养[6]。经过1 个月的饲养实验组去除高糖饮水，剪除结扎的丝线。通过X线检查、PD和SBI确定牙周炎模型建立成功。将实验组按照随机原则分为牙周炎未治疗组(牙周炎组)，牙周炎应用盐酸米诺环素软膏组(派丽奥组)和牙周炎应用盐酸米诺环素软膏联合塞治剂组(塞治剂组)各12 只。
1.2.2 牙周炎的诊断
牙周炎造模1 个月后，3 名经过训练和校正的牙周科医师的检测结果取均值，其中SBI的均值为4.75±0.50、PD的均值为(9.88±0.85)mm，X线检查发现牙槽骨吸收，并有不同程度的骨质疏松，确认牙周炎造模成功。
1.2.3 组织的收集
对照组、牙周炎组、派丽奥组、塞治剂组在牙周炎模型建立成功后1 周、2周、4 周分次处死。分离前牙，去除肌肉、保留牙周组织，肉眼观察，标本冲洗，立即浸入40 g/L的多聚甲醛中固定24 h，常规脱水，浸蜡，包埋，沿与牙齿长轴平行的方向制备颊舌向连续4 μm厚的组织切片，HE染色，组织学观察并照相。
1.2.4 免疫组化程序(SP法)
石蜡切片脱蜡至水，用柠檬酸缓冲液和高压加热作抗原修复，正常羊血清孵育20 min，加一抗4 ℃孵育过夜，加生物素标记的二抗，孵育30 min，加底物DAB显色，冲洗中止反应，苏木精复染，封片，光镜观察。
1.2.5 免疫组化法检测Bc1-2蛋白表达
一抗以1：100倍数进行稀释，DAB显色。阳性表达细胞被染成棕黄色，随机选取3个视野，400倍光镜下计算单位视野阳性表达率(阳性细胞数/观察细胞总数，%)，辅以计算机图像分析仪分析结果。
1.2.6 统计学处理
实验数据以均值±标准差(±s)表示，采用SPSS13.0软件进行重复测量的方差分析，P&<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 肉眼观察
4周时对照组牙龈乳头正常，上皮附着位于釉牙骨质界处， 牙周膜纤维排列整齐，牙槽嵴顶高度正常。牙周炎组牙龈乳头丧失，上皮钉突增生成条索状或网眼状，大部分胶原纤维溶解丧失，被炎症细胞取代，挤压时有脓液溢出，牙槽骨重度吸收。派丽奥组牙龈乳头退缩，牙周组织胶原纤维束排列紊乱，有炎症细胞浸润，牙槽嵴顶高度轻度吸收。塞治剂组牙龈乳头基本正常，上皮附着位于釉牙骨质界处，牙周膜纤维排列不规则，牙槽嵴顶高度轻度吸收。
2.2 组织学观察
光镜下对组织切片观察见: 对照组：附着上皮和牙周膜无病理性改变。牙周炎组:血管充血扩张明显，附着上皮破坏。可见牙周膜主纤维排列紊乱，极性丧失，个别区域纤维束中断，局部组织坏死。派丽奥组:新生牙周纤维在牙周膜间隙中穿行，纤维排列不规则。塞治剂组:新生牙周纤维细小稠密，富含血管其方向与根面垂直或接近垂直，与正常牙周韧带结构相似。
2.3 Bcl-2 的表达
4周时对照组Bcl-2染色为棕黄色，数量较多，主要位于基底细胞层中。牙周炎组牙龈的基底细胞层中有Bcl-2的零星散在的分布。派丽奥组主要位于基底细胞层中，Bcl-2染色呈淡黄色，主要位于基底细胞层。塞治剂组的牙龈中Bcl-2的表达增强.主要位于基底细胞层，另外在棘细胞层也有少量散在分布。
2.4 治疗结果
2.4.1 治疗前后各组PD的比较(表1)。表1 各组治疗前后PD的比较牙周探诊深度PD的变化：
1周时F检验F=70.78，有显著性差异，(P&<0.01)。2周时F=26.00，除派力奥组与塞治剂组P=0.294&>0.05，其余各组均有显著性差异。(P&<0.01)。3周时，F=65.87，有显著性差异(P&<0.01)
2.4.2 治疗前后各组SBI的变化(表2)。表2 各组治疗前后SBI的变化 龈沟出血指数SBI的变化：
1周时F检验F=39.90，除派力奥组与塞治剂组P=0.952&>0.05，其余各组均有显著性差异(P&<0.01)。2周时F=21.78，除派力奥组与塞治剂组P=0.127&>0.05，其余各组均有显著性差异(P&<0.01)。3周时F=14.70，除牙周炎组与派力奥组P=0.952&>0.05，其余各组均有显著性差异(P&<0.05)。
2.4.3 Bcl-2阳性表达率比较(表3)。表3 各组治疗前后Bcl-2阳性表达率的变化 Bcl-2阳性表达率的变化：
1周时F检验F=17.33，除派力奥组与塞治剂组P=0.19&>0.05，其余各组均有显著性差异(P&<0.01)。2周时F=32.26，除派力奥组与塞治剂组P=0.329&>0.05，其余各组均有显著性差异(P&<0.01)。3周时F=64.68，各组均有显著性差异(P&<0.01)。
3 讨 论
3.1 物理机械刺激制模 常用的结扎材料是丝线，也有用棉线、弹性橡皮圈、正畸用钢丝作为结扎材料的[7]。丝线结扎方便且效果较好，被广泛应用于牙周炎动物模型的建立[8]。本实验利用丝线结扎兔的前牙，目的是使局部滞留食物，形成菌斑、牙石，造成局部刺激，加速牙周组织的破坏[9]。本实验选择临床上1个月内局部及全身未服用抗生素的牙周炎患者的牙石放入肉汤管内，置37 ℃恒温箱中24 h后使用是促进牙石内的厌氧菌的繁殖，加快牙槽骨的吸收。
3.2 盐酸米诺环素软膏其主要成分二甲胺四环素是一种新型半合成四环素，具有高效光谱作用。易渗透，比四环素抗菌作用强2～4倍[10]。盐酸米诺环素软膏能有效抑制致病微生物、降低龈沟液中弹性蛋白酶水平、降低龈沟液中胶原酶的活性，降低结缔组织的破坏程度，阻止骨吸收，促进牙周组织再生 [11]。盐酸米诺环素软膏已被建议作为对牙周疾病的最有效的药物之一[12]。
3.3 牙周塞治剂有隔离唾液作用，在牙周炎的治疗过程当中能明显的减少牙周袋的PD，附着水平也大大增加，在牙周袋手术后用于保护创面，保护伤口面积，防止肉芽组织的过度生长[13]。敷料在7～8天后取出效果较好[14]。
3.4 细胞凋亡是细胞受基因调控的非坏死性死亡，它和细胞增殖二者的动态平衡维持着机体内环境的稳定[15]。调节细胞凋亡基因的突变或蛋白水平表达的改变，将抑制或促进细胞凋亡的发生[16]。在这些基因中，Bc1-2蛋白家族与细胞凋亡关系最密切[17，18]。Bcl-2蛋白的生理功能主要是阻遏细胞凋亡，延长细胞寿命，对细胞周期和分化不产生影响。Bcl-2基因是通过抑制caspase 9激活，从而抑制细胞死亡[19]。细胞凋亡与牙周炎之间的研究大多集中在对牙槽骨的影响，本实验的目的是探索Bcl-2是否在牙龈中也有明显表达，从而为临床取少量牙龈标本即可客观评价牙周炎的程度提供可行性。本实验的结果证明牙龈组织中Bc1-2的浓度随龈沟深度的增加而进行性下降，两者呈负相关，牙龈中Bcl-2下降有利于牙龈炎症微环境的形成进而加重牙周病。治疗前后各组Bcl-2阳性表达率有显著差异(P&<0.05)，证明Bcl-2是牙周炎的敏感指标。
3.5 牙周病是牙菌斑微生物引起牙周组织感染的口腔慢性炎症性疾病。及时和适当的治疗措施，可防止出现急性炎症反应和慢性疾病及进展的可能，加大对稳态恢复的可能性。在牙周疾病，典型干预程序如根面平整，可以消除部分致病的原因，从而帮助牙周疾病的恢复[20]。本实验的目的就是应用牙周塞治剂提高盐酸米诺环素软膏的治疗效果，减少患者就诊的次数，提高药效的浓度，减少龈沟液及其它物质的冲刷作用，保证牙周炎在较短的时间内有较好的疗效。本实验通过Bcl-2的阳性表达率、PD和SBI证明牙周塞治剂对盐酸米诺环素软膏的治疗效果有明显的提高。
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