作者：曹阳，吕刚，于洋，范仲凯
【摘要】 目的 研究骨髓基质细胞的CXCR4表达，SDF-1对BMSCs迁移、趋化作用，分析促进迁移规律和机理。为改善和提高骨髓基质细胞迁移能力寻找更有效的途径。为临床骨髓基质细胞更广泛的应用奠定基础。方法 体外培养大鼠骨髓基质细胞，应用免疫组化方法对骨髓基质细胞的CXCR4受体表达水平进行检测，运用微孔隔离室穿越实验方法，研究SDF-1对骨髓基质细胞迁移、趋化作用，并用SDF-1阻断剂加以证实。结果 CXCR4在各代骨髓基质细胞中表达小于5%，SDF-1可促进骨髓基质细胞迁移。结论 虽然CXCR4在骨髓基质细胞中表达量很少，但是对促进骨髓基质细胞迁移起到至关重要的作用。
【关键词】 骨髓基质细胞;基质细胞衍生因子-1;迁移
Abstract: Objective To investigate CXCR4 expresstion of bone mesenchymal stroma cells， and the effects of SDF-1/CXCR4 in promoting migration of bone mesenchymal stroma cells and to analyze the mechanism of migration of bone mesenchymal stroma cells， which aims to find more effective ways of improving migration ability. Methods Bone mesenchymal stroma cells of rats were cultured in vitro. Receptor of CXCR4 was detected by immunohistochemistry. Migration of marrow stroma cells were investigated by empirical method of transwell. Results The receptor of CXCR4 on bone mesenchymal stroma cells was less than 5%， and SDF-1 could promote migration of bone mesenchymal stroma cells. Conclusions Although there is a little the receptor of CXCR4 on bone mesenchymal stroma cells， which plays an important role in promoting migration of bone mesenchymal stroma cells.
Key words:bone mesenchymal stroma cells (MSCs); stromal cel1 derived factor-l (SDF-1); migration
基质细胞衍生因子-1(stromal cel1 derived factor-l，SDF-1)及其趋化因子受体(CXCR4)作为一个趋化因子家族的新成员，在调节造血过程中发挥重要的作用。它在骨髓微环境中的高表达与造血干/祖细胞释放至外周血循环有关，并可作为一个评价造血动员过程中CD34+细胞峰值出现的指标。近来研究表明，SDF-1对多种干细胞和成体细胞有趋化作用，而且是多种干细胞、肿瘤细胞和淋巴细胞的生长因子。因此，随着对SDF-1/CXCR4研究的不断发展，人们愈来愈关注其在多种生物学效应中的重要作用。
SDF-1对细胞的趋化作用是通过其受体CXCR4来调节、是己知的CXCR4的唯一配体。研究表明，SDF-1可诱导大多数循环淋巴细胞和CD34+前体细胞的黏附，使细胞定向性迁移致特殊部位，但SDF-1对CD34-细胞是否有趋化作用尚有争论。本实验目的是运用微孔隔离室穿越实验方法，研究SDF-1对BMSCs迁移、趋化作用，并用SDF-1阻断剂加以证实。
1 材料与方法
1.1 材料
SDF-1(R&&D，英国)，CXCR4阻断型Ab(R&&D公司)。DMEM培养液(Gibco，BOSTER )，胎牛血清(BOSTER)，3月龄雄性SD大鼠，兔抗鼠多克隆抗体CD34，CD44，CD45，CD54、CXCR4(BOSTER)，免疫组化(SP)试剂盒(BOSTER公司)。倒置像差显微镜(OLympas CK40)，CO2培养箱(Toua3法国)，自动酶标检测仪(BioRad 550，美国)，Transwell-clear48孔板(Costar，美国)，孔径8 μm。CO2培养箱(Heraeus)，超净工作台(Nuair)，低速离心机(Heraeus)，胰蛋白酶(Sigma)。
1.2 方法
1.2.1 骨髓基质细胞分离和培养
大鼠颈椎脱臼处死后，取其双侧股骨和胫骨。在超净台内剪断上下干骺端，用含10%胎牛血清的DMEM注射器插入骨髓腔冲洗，将骨髓细胞冲入培养皿中，用DMEM培养液冲洗，轻轻吹打，然后加入适量的DMEM(含10%胎牛血清)，置37 ℃，5% CO2培养箱培养。每日在倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况。2天后换液，以去除未贴壁的血细胞，以后每隔3天换液1次。培养细胞铺满后用0.25%胰蛋白酶1∶2消化传代。免疫组织化学方法对MSCs进行鉴定
1.2.2 免疫组织化学方法检测MSCs中CXCR4表达
Poly-Lysine玻片防脱片剂处理，取2-10代MSCs细胞制成细胞爬片，4%多聚甲醛固定20 min，30%h3O2 1份+蒸馏水10 份混合，室温5～10 分钟。蒸馏水洗3次。滴加5%BSA封闭液，室温20 分钟。甩去多余液体。滴加稀释的一抗(CD34∶1∶200、CD44∶1∶200、CD54∶1∶200、CXCR4∶1∶100)，37 ℃ 1 小时。PBS洗2 分钟×3 次。滴加生物素化山羊抗兔IgG，37 ℃20 分钟。PBS洗 2分钟×3 次。滴加试剂SABC，37 ℃20分钟。PBS洗5 分钟×4 次。使用DAB显色试剂盒(AR1022)显色。蒸馏水洗涤。脱水，透明，封片。同样方法对神经胶质细胞中CXCR4检测进行对照。显微镜观察，MSCs细胞表面CXCR4的检测：以细胞胞浆中显示棕黄色颗粒定为阳性反应。每张涂片计数100个细胞;依细胞的反应强度计分(0～4 分)，计算细胞的平均反应强度的积分值(%)。
1.2.3 微孔隔离室穿越实验
每六孔为一组，transwell经无血清的DMEM培液于培养箱中平衡1 小时;消化细胞(2代)，无血清培养基洗2 次，计数，配成(1×106/mL)细胞悬液，上室每孔加入 100 μL 细胞悬液;Transwell板下室分别置、含不同浓度的重组人SDF-1(0、50、100、150、200、250、300 ng/mL)的无血清的DMEM，另取一组上、下室同时加入100 ng/mLSDF-1，置于5% CO2，37 ℃饱和湿度培养箱培养24 h;用棉球擦去上表面细胞，PBS洗2 遍，5%戊二醛固定，显微镜下观察计数。
1.2.4 阻断试验
将CXCR4阻断型抗体20 g/mL和20%FBS的 DMEM空白对照分别与1×106/mL BMSCs作用20 min后，加入上室;BMSCs培养上清液、含100 ng/mL SDF-l的DMEM及DMEM空白对照置于transwell板下室， 37 ℃饱和湿度培养箱温育24 h，用棉球擦去上表面细胞，PBS洗2遍，5%戊二醛固定，显微镜下观察计数。
1.2.5 统计方法
计数穿过微孔及黏附于膜下表面的细胞，随机取5个视野(光镜200×)的细胞数。数据使用均值±标准差表示。应用EXCELL2003统计软件对实验数据进行方差分析及q检验。
2 结 果
2.1 CXCR4抗原表达
原代培养骨髓基质细胞约24～48 h贴壁，细胞初为淋巴细胞样小圆细胞。约7～l0 d可铺满培养皿，细胞融合成单层。此时细胞为多角形、三角形或梭形，呈集落状生长。传代培养原代细胞逐渐伸展为梭形、三角形、多角形，胞体较原代略膨大，有胞浆突起，成旋涡或平行状排列。5～7 d即可长满。MSCs鉴定： MSCs免疫组化显示CD34、CD45表达阴性，CD44、CD54表达阳性，第5代MSCs特异性表面标志物CD44， CD54表达率分别是99.5% ，98.1%(图1)。
免疫组化显示MSCs有CXCR4抗原表达，但表达量很少，2代阳性率5.2%(图2)，以后逐渐减少、减弱，3代1.6%，4代1.1%，5代以后几乎无阳性表达。
2.2 SDF-1诱导细胞迁移的结果
当下室无SDF-1，BMSCs细胞迁移细胞数为8±3.41，当下室加入SDF-1趋化因子，BMSCs细胞迁移细胞数明显增加，表明SDF-1能够显著增加诱导迁移细胞，SDF-1浓度分别为50、100、150、200、250、300 ng/mL时迁移细胞数为(10.45±4.51)，(15.66±3.25)，(20.51±5.34)，(21.23±5.38)，(21.07±5.17)，(22.01±4.88);加入SDF-1组与未加SDF-1组相比有显著差异(P&<0.01)。在0～150 ng/mL浓度内SDF-1诱导BMSCs呈浓度依赖关系，达到最佳迁移效果的SDF-1浓度为150 ng/mL，再增大SDF-1浓度后，迁移的BMSCs增加数目不明显，无统计学差异(P&>0.05)见表1。上、下室同时加入SDF-1，迁移细胞数与无SDF-1组无明显差别(P&>0.05)。表1 SDF-1浓度对细胞迁移细胞数影响SDF-1浓度
2.3 CXCR4阻断型抗体对BMSCs细胞迁移的影响结果
CXCR4阻断型抗体对BMSCs细胞迁移的影响结果，经过CXCR4抗体孵育后，迁移细胞数与未加SDF-1组无明显差别(P&>0.05)见表2，迁移效应被抵消，进一步表明SDF-1对BMSCs的迁移影响。表2 加入CXCR4阻断型抗体后BMSCs细胞迁移数量SDF-1浓度
3 讨 论
3.1 趋化因子受体CXCR4在骨髓基质细胞表达特点
趋化因子受体CXCR4是G蛋白偶联的7次跨膜蛋白受体。通过和其配体基质细胞衍生因子-1 (Stromal cell derived factor 1，SDF-1)的相互作用在炎性细胞的浸润和淋巴细胞移行、归巢中发挥着重要作用。虽然CD34+细胞跨过内皮屏障的迁移受更多趋化因子的调节，但主要的是SDF-1[1，2]。有研究证实，MSCs可表达CXCR4，但也有人认为MSCs不表达CXCR4。通过流式细胞术检测显示活化的CXCR4，发现CXCR4仅表达于小部分MSC亚型的表面[3]。本研究可看到，在原代培养过程的MSCs就表达CXCR4的受体，此时MSCs分泌的SDF-1对于MSCs起作用，并可以使MSCs进行定向迁移。但为什么MSCs表达CXCR4水平存在争议，可能和MSCs所处细胞周期有关，快速增殖的MSCs细胞呈现高表达CXCR4。
3.2 SDF-1在骨髓干细胞的细胞迁移中起重要作用
SDF-1是造血干/祖细胞动员和归巢的关键因子，有研究提示，SDF-1通过调节VLA-4表达介导CD34+的细胞的粘附，在CD34+细胞归巢至骨髓中发挥关键作用，并由此影响其在骨髓中的增殖和分化，使干细胞具有迁移归巢的特性。有研究提示在心梗时期有促使干细胞迁移到心梗部分以及周围组织，可能与部分趋化因子有关，譬如：Stem Cell Factor(SCF)，CXCR4 and Stromal Cell–Derived Factor-1(SDF-1)，Granulocyte Colony-Stimulating Factor(G-CSF)，Vascular Endothelial Growth Factor(VEGF)，而具体机制仍不清楚[4]。大量的研究不断证实SDF-1在骨髓干细胞的细胞迁移中起重要作用，并且发现来源于骨髓、脐血动员的外周血中的CD34+造血干/祖细胞表面表达其相应受体CXCR4，而SDF-1能特异性地对CXCR4产生趋化作用，在体外实验中通过对MSCs转染CXCR4基因，增加MSCs表面cxcR4的表达，大大增加了SDF-1对MSCs的趋化作用，进而证实了SDF-1通过受体CXCR4对MSC产生趋化作用。
3.3 SDF-1浓度梯度作用及机制
本实验中可以看到SDF-1浓度梯度在MSCs的迁移中发挥着重要作用，而当CXCR4被阻断后，这种定向迁移也就被阻断。除了运用CXCR4及SDF-1抗体，运用各种途径提高骨髓SDF-1的浓度也可以达到促进移植细胞归巢到骨髓的目的。降低骨髓内SDF-1的浓度或提高骨髓外SDF-1的浓度，所产生的骨髓内、外SDF-1浓度梯度都可以促进骨髓干细胞的动员。
目前对SDF-1对MSCs的趋化作用活体实验也有相关报道，并且发现SDF-1对骨髓基质细胞的趋化作用还需要组织器官存在损伤区域。发现无心肌梗死小鼠中无论有无SDF-1的表达，都仅有少量的骨髓干细胞迁徙到心肌中，但与心肌梗死组有明显差异;提示骨髓干细胞在活体中归巢不只是需要SDF-1的趋化作用，心肌梗死区域的存在本身就具有重要作用[5，6]。
通过transwell plate检测发现，在添加SDF-1的情况下，造血干/祖细胞的迁移率增加。因此SDF-1能介导造血干/祖细胞跨越骨髓内皮细胞层迁移的过程。SDF-1吸附在内皮细胞表面的蛋白多糖上，结合CD34+细胞表面的CXCR4而捕获造血干/祖细胞。在黏附分子LFA-1/ICAM-1和VLA-4/VCAM-1的参与下，造血干/祖细胞与内皮细胞产生黏附。而内皮细胞表面表达的SDF-1不仅能捕获迁移中的造血干/祖细胞，同时能通过CXCR4介导的细胞反应，如上调黏附分子的表达，激活干/祖细胞穿越内皮细胞层的迁移运动。如此，动员的外周血中表达CXCR4的造血干/祖细胞，在骨髓基质SDF-1的趋化作用下向骨髓迁移。
总之随着干细胞领域基础研究的迅速进展，各种来源的干细胞已经广泛应用到各器官疾病治疗的基础研究和早期临床实验中。骨髓基质细胞取材方便，体外扩增快速，且适合于自体移植，具有对病灶的趋化特性，是良好的转基因治疗的靶细胞。能否通过SDF-1来调控骨髓基质细胞向靶组织的迁移分化，有望为今后的研究提供新的思路。骨髓基质干细胞移植后，细胞迁移和增殖水平对于损伤部位是非常重要的，但是目前发现其作用是很小的。如何提高在治疗区域的细胞含量是提高临床治疗疗效的关键。Stromal-derived factor-1(SDF-1)被证明对干细胞的迁移起到重要作用，同样也是骨髓基质细胞迁移的关键因素，因此提高其配体CXCR4在骨髓基质细胞中的表达，将会对其增殖、迁移起到促进作用。本研究提示CXCR4存在于骨髓基质细胞，在细胞表面表达很少。如果能够动员细胞内部受体，增加其表达将会提高骨髓基质细胞的募集，为其临床应用提供广阔前景。
参考文献
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