表面修饰对纳米晶胶原基骨细胞相容性的影响

　　　　作者：马鹏， 徐成振， 徐晓峰， 陈静， 龚爱华， 张志坚

【摘要】 目的： 探索纤维蛋白(fibrin，FB)修饰的纳米晶胶原基骨(nanoHydroxyapatite/collagen，nHAC)支架材料上成骨诱导的骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells， MSCs)黏附、增殖及分化的情况。方法： 实验分为两组：实验组，纤维蛋白修饰的纳米晶胶原基骨(FBnHAC)；对照组，单纯的纳米晶胶原基骨(nHAC)。将SD大鼠骨髓间充质干细胞定向诱导为成骨细胞，种植于支架材料上，体外复合培养。通过检测支架材料的细胞黏附率、不同时间点(3，7，10，14 d)支架材料中细胞数、碱性磷酸酶表达量以及扫描电镜观察细胞在支架材料上的生长状况，比较分析不同支架材料与细胞生物相容性差异。结果： 大鼠MSCs经诱导培养14 d后，I型胶原免疫荧光染色为阳性；实验组支架材料的细胞黏附率显著高于对照组(P&<0.05)；且相同时间点实验组支架材料中的细胞数及碱性磷酸酶表达量也明显高于对照组(P&<0.05)；电镜观察发现两组材料上均有细胞生长，但实验组的细胞生长状况明显好于对照组。结论： 表面修饰纤维蛋白后的nHAC支架材料具有更好的细胞黏附、增殖及促成骨分化能力。

【关键词】 纤维蛋白； 修饰； 纳米晶胶原基骨； 组织工程骨

　　［Abstract］ Objective: NanoHydroxyapatite/collagen(nHAC) modified with fibrin was prepared， and the adhesion， proliferation and differentiation of marrow mesenchymal stem cells on the scaffolds were investigated.Methods： MSCs obtained from SD rat bone marrow were induced and proliferated. After their osteoblastic phenotypes were demonstrated， MSCs were seeded onto nHAC modified with fibrin(experiment group) and common nHAC(control group). The adhesive rates were calculated respectively. At different time points(3， 7， 10，14 d)， the number of the cells in the scaffolds was counted and alkaline phosphatase(ALP) activity was detected. The cells growth on scaffolds also was observed by scanning electron micrograph(SEM).The differences between groups were compared and analyzed. Results： The differentiation of MSCs to osteoblastic phenotype were demonstrated by the positive staining of collagen type I. The efficiency of cell adhesion in the modified nHAC was higher than the unmodified nHAC(P&<0.05). The cell number and ALP activity of MSCs adhered to nHAC modified by fibrin were obviously higher than that of MSCs adhered to simple material(P&<0.05). Cells could be observed on every scaffold by SEM， but cells on the modified nHAC grew obviously better than that on the unmodified nHAC. Conclusion： nHAC modified with fibrin had a better cell adhesion， proliferation and facilitate bone formation ability.

　　［Key words］ fibrin; modification; nanoHydroxyapatite/collagen; tissue engineered bone

　　严重创伤、炎症、肿瘤、先天性畸形等导致的节段性骨缺损是骨科医师面临的临床难题之一。利用组织工程技术构建组织工程骨治疗骨缺损是具有临床应用价值的治疗策略，其中支架材料是构建组织工程骨的关键要素之一，理想的支架材料应有利于种子细胞的黏附、增殖及分化，并在体内能形成生物活性组织。纳米晶胶原基骨（nanoHydroxyapatite/collagen，nHAC）已经作为人工合成生物支架材料替代骨缺损应用于临床［1］，研究表明其复合细胞后具有体内成骨能力［2］。为了进一步提高nHAC的细胞相容性，本研究充分利用纤维蛋白（fibrin，FB）的生物学特性，对nHAC进行表面修饰处理，以促进成骨诱导的骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs)在nHAC上的黏附、增殖及分化，为骨组织工程提供一种支架材料的表面修饰手段。

　　1 材料和方法

　　1.1 动物和试剂
　　
　　健康雄性SD大鼠，体质量约100 g，由江苏大学动物实验中心提供；纳米晶胶原基骨，由清华大学材料系提供；LDMEM、胎牛血清、胰蛋白酶(Gbico公司)；地塞米松、维生素C、β甘油磷酸钠、纤维蛋白原、Cy3标记的羊抗小鼠IgG、hoechst33342（Sigma公司）；小鼠抗大鼠I型胶原单克隆抗体(Santa Cruz公司)；新鲜血浆自制；碱性磷酸酶检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 SD大鼠MSCs的获得与成骨诱导 颈椎脱臼处死大鼠，无菌条件下取其股骨、胫骨， 用含体积分数10%胎牛血清的LDMEM 培养液冲洗骨髓腔以冲出骨髓，淋巴细胞分离液分离后，置入含10%胎牛血清、10 nmol/L地塞米松、50 mg/L维生素C、 10 mmol/L β甘油磷酸钠的LDMEM培养基中，37℃、5%CO2 孵箱中培养，3～4 d后首次半量换液，去除不贴壁细胞，以后每2～3 d换液1次，倒置显微镜下观察细胞贴壁及生长分化情况。

　　1.2.2 FBnHAC支架材料的制备 将纤维蛋白原(fibrinogen，FG)(w/v，10%)溶于LDMEM中，nHAC切割成5 mm×5 mm×5 mm大小，置于FG/LDMEM中4℃过夜，处理24 h，取出后浸泡于新鲜的大鼠血浆中，迅速取出置于24孔培养板中备用。

　　1.2.3 I型胶原免疫荧光染色 大鼠MSCs经诱导培养14 d后，吸去培养基，固定细胞，PBS洗涤0.25%TrixonX100 37℃水浴1 h，3%牛血清白蛋白封闭，加小鼠抗大鼠I型胶原单克隆抗体（1∶100），4℃ 24 h，再37℃水浴4 h，PBS洗涤，滴加Cy3红色荧光标记的羊抗小鼠IgG（1∶300），37℃水浴1 h，PBS洗涤，加hoechst33342，室温5 min，PBS洗涤，甘油封固，荧光显微镜下观察。

　　1.2.4 构建组织工程骨 0.25%胰酶消化成骨诱导的MSCs，制成2×106/ml的细胞悬液， 吸取100 μl分别滴加到已置入24孔板的FBnHAC，nHAC材料表面，37℃，5%CO2，饱和湿度静置2 h后，反转材料，向每组材料另一面滴加100 μl细胞悬液， 37℃， 5%CO2，饱和湿度静置培养2 h后，加上述成骨诱导培养液浸没材料，置于孵箱中培养，在不同时相点（3，7，10，14 d)分别取材进行各项指标的观测。

　　1.3 观测指标

　　1.3.1 材料的细胞黏附率测定 接种后4 h分别取每组材料3个样本， 0.25%胰蛋白酶消化， PBS洗涤3次，使黏附在材料上的细胞脱落， 细胞计数板进行计数，根据公式:细胞黏附率=(黏附细胞数/接种细胞数)×100%，计算细胞黏附率。

　　1.3.2 增殖细胞计数 细胞支架材料复合培养到第3，7，10，14天时，每组材料各取样本3块，PBS洗涤3遍，0.25%胰酶消化细胞，反复吹打支架后加入等量含10%FBS的培养基终止消化，取出支架，培养液离心，制悬，计数。

　　1.3.3 碱性磷酸酶表达量检测 上述计数后的细胞悬液，在冰浴中用超声细胞破碎机处理5次，6 s/次，共30 s。然后1 000 r/min离心5 min，取上清液按试剂盒介绍的方法算出碱性磷酸酶表达量。

　　1.3.4 扫描电镜观察 细胞与支架材料联合培养7 d，每组分别取出1块细胞支架复合物，10%的戊二醛固定，乙醇梯度脱水，临界点干燥，喷金，扫描电镜下观察细胞生长情况。

　　1.4 统计学分析
　　
　　实验数据以均数±标准差（±s）表示，采用SPSS11.5统计软件中的两独立样本间的t检验，P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 MSCs的成骨诱导培养
　　
　　MSCs 24 h后部分贴壁，贴壁细胞呈圆形或椭圆形，少部分细胞悬浮。5 d左右细胞铺满瓶底，多为梭形，形态比较一致，呈鱼群样排列（图1）。10 d后细胞形态开始发生明显变化， 部分细胞由长梭形转变为立方形或多角形。

　　图1 MSCs培养第5天形态(倒置显微镜×100)（略）

　　Fig 1 Morphologic characterization of MSCs for 5 d(inverted microscope×100)

　　2.2 I型胶原免疫荧光染色
　　
　　大鼠MSCs经成骨诱导培养14 d后， I型胶原免疫荧光染色阳性，红色荧光(Cy3)表示I型胶原在细胞内的分布，蓝色荧光(hoechst33342)为细胞核(图2)。
　　
　　图2 Ⅰ型胶原免疫荧光染色(荧光显微镜×400)（略）

　　Fig 2 Induced MSCs showing positive expression of　collagen type I(fluorescent microscope×400)

　　2.3 材料的细胞黏附率测定
　　
　　接种4 h后，纤维蛋白表面修饰后的支架材料细胞黏附率比非处理组明显提高，分别为：实验组(58.8±2.9)%，对照组(38.8±1.8)%。两组之间比较差异有统计学意义(P&<0.05)。

　　2.4 增殖细胞计数　
　　
　　两组材料中细胞随培养时间延长逐渐增多，且相同时相点实验组材料上的细胞数量均多于对照组，两组间比较差异有统计学意义(P&<0.05)。具体细胞数见表1。
　　
　　表1 支架材料上细胞计数（略）

　　a：与对照组比较，P&<0.05
　　
　　2.5 碱性磷酸酶表达量检测　
　　
　　如图3所示，两组碱性磷酸酶表达量第10天时到达最高峰，相同时相点实验组碱性磷酸酶表达量高于对照组(P&<0.05)。

　　图3 两组支架材料碱性磷酸酶表达量检测（略）

　　Fig 3 Expression of ALP in two groups

　　2.6 扫描电镜观察支架材料及细胞支架复合物
　　
　　nHAC(图4a)和FBnHAC复合材料(图4b)电镜下显示:FBnHAC的结构与nHAC基本一致，FBnHAC孔隙表面覆盖了一层薄的网状结构，但孔隙大小未受影响。7 d后电镜下可见两组材料上均有细胞生长，细胞在FBnHAC的表面和孔隙内生长良好，黏附的细胞数量较多，分泌的细胞外基质可见(图4c)。nHAC表面黏附的细胞明显减少，细胞之间少有突起连接(图4d）。
　　
　　(a) nHAC结构（×200)

　　(b) FBnHAC结构，孔隙内可见网状结构（×200)
　　
　　(c) FBnHAC表面黏附的细胞较多，可见细胞外基质形成（×500)
　　
　　(d) nHAC表面黏附的细胞明显减少（×500)

　　图4 支架材料以及细胞支架联合培养7 d 扫描电镜观察（略）

　　Fig 4 Scoffolds and MSCs cultured together with　the scoffolds for 7 days were observed by　scanning electron microscope

　　3 讨论
　　
　　骨组织工程是指利用组织工程技术构建组织工程骨进行骨组织缺损的修复或重建。组织工程骨的构建可以分为3个主要步骤:种子细胞的增殖分化、支架材料的合成→种子细胞与支架材料复合→组织化人工骨植入体内，其中种子细胞和支架材料的选择尤为重要。MSCs来源广泛且在体外可大量扩增，在不同的诱导条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、肌肉细胞、神经细胞等多种细胞，目前已成为骨组织工程最重要的种子细胞［3］。成骨诱导培养后的大鼠MSCs为贴壁依赖型细胞， 与支架材料的生物相容性差异会影响细胞黏附、增殖、分化以及功能的表达。所以理想的支架材料必须具有良好的生物降解性和生物相容性、适宜的表面亲水-疏水平衡、较强的细胞特异性识别能力以及一定的机械强度。目前， 清华大学廖素三等［4］研制的nHAC是基于仿生观念骨替代材料，有良好的生物降解性和骨传导性，晶体尺寸在纳米量级， 且晶体和胶原分子的组装结构与天然骨中矿物和胶原的组装结构相同，具有与天然松质骨类似的三维孔洞网络结构，孔隙大小约100 μm，有利于营养物质的运输。孙伟等［5］应用nHAC材料和MSCs进行复合培养证实， nHAC可以作为支架材料应用于骨组织工程，且能与MSCs复合。
　　
　　为了提高nHAC与细胞的生物相容性，对其进行一定的表面修饰是非常必要的。表面修饰旨在引入细胞与支架材料特异性相互作用位点，使细胞尽可能在类似体内细胞外基质环境中发挥其功能。本研究应用纤维蛋白表面修饰nHAC的方法简单，可行性强，不但充分利用了所选用的细胞外基质蛋白的生物学特性， 而且保留了nHAC原有的基本结构。在修饰支架的过程中加入新鲜大鼠血浆，以提供活化的凝血酶及各种细胞因子，促使可溶的纤维蛋白原转化为不溶的纤维蛋白，纤维蛋白可互相交织形成三维网状结构覆盖在nHAC孔隙表面，该网状结构有良好的组织相容性，能较好地介导细胞信号传导和细胞间相互作用，可释放转化生长因子和血小板衍生因子促进细胞黏附和增殖，并为细胞生长提供三维仿生空间。陈克明等［6］采用纤维蛋白作为载体材料复合MSCs，证实了纤维蛋白具有细胞可黏附性、合适的孔隙结构，是细胞培养的良好载体。
　　
　　扫描电镜观察纤维蛋白修饰后的nHAC，我们发现在nHAC表面及孔隙内覆盖一层薄的网状样结构，但孔隙大小未受影响，证实纤维蛋白成功修饰了nHAC。我们的研究表明，成骨诱导的MSCs复合纤维蛋白修饰的nHAC培养，材料表面及孔隙内黏附了大量的细胞，并可见细胞外基质的分泌；成骨诱导的MSCs复合单纯的nHAC培养，材料表面及孔隙内分布少量细胞，细胞外基质少见，说明纤维蛋白修饰后的nHAC材料的细胞相容性明显优于单纯材料。随着培养时间的延长，细胞增殖数量实验组也均高于对照组，可能由于纤维蛋白还进一步改变了nHAC的亲水性和带电性，促进生长过程中的细胞汇合， 进而细胞通过旁分泌和自分泌作用进一步促进其自身的增殖生长。碱性磷酸酶表达量检测结果显示各时间点实验组显著高于对照组，说明成骨细胞在FBnHAC材料上的生长分化优于单纯的nHAC材料，从另外一个方面也可说明新鲜大鼠血浆中的转化生长因子、血小板衍生因子等可促进尚未分化的MSCs向成骨细胞分化，结果进一步提示纤维蛋白表面修饰对nHAC材料的细胞相容性有一定的优化作用。
　　
　　总之，纤维蛋白修饰后的nHAC支架材料能促进成骨定向诱导的MSCs黏附、增殖及分化，一定程度上完善了nHAC材料的细胞相容性，为该支架材料进一步应用于骨组织工程奠定了基础。

参考文献

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　　［2］ Zhu JZ，Miao ZN，Qian HG.Bone formation performance by autograft of rabbit mesenchymal stem cells cocultured with nano basal hydroxyapatite materials［J］. Chinese Journal of Clinical Rehabilitation， 2006， 10(41):195-197.

　　［3］ Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells［J］.Science，1999，284(5411):143-147.

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　　［5］ 孙 伟，李子荣 张 岚，等.纳米晶胶原基骨与骨髓间充质干细胞复合培养对表型影响［J］.中国误诊学杂志，2006，16(8):1419-1421.

　　［6］ 陈克明，葛宝丰，刘兴炎，等. 纤维蛋白用做骨组织工程载体并修复骨缺损［J］.中国矫形外科杂志，2005，13(16):1241-1243.