作者：徐华，万定，杨晓明，杨晓玲，李桂忠，王恬，吴海，曹军
【摘要】 目的 观察饮用绿茶对大鼠血管钙化的影响及其可能机制。方法 用肌注维生素D3和灌胃尼古丁诱导大鼠血管钙化模型。实验分为对照组、钙化组、低剂量和高剂量绿茶干预组。Von Kossa染色，原子吸收分光光度法测定钙含量，放射免疫分析法测定血浆、血管骨钙素(osteocalcin，OC)、血管紧张素Ⅱ(angiotensin II，AngⅡ)及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性。结果 钙化组大鼠血管染色见平滑肌细胞内和细胞间基质有大量黑色颗粒聚集；与对照组相比，主动脉钙含量、ALP 活性、OC和AngⅡ含量均有明显增加；采用50 g/L和100 g/L绿茶防治大鼠均可抑制血管钙化，且高剂量时效应强于低剂量；与钙化组相比较，血管组织钙化指标均下降，而主动脉AngⅡ含量亦有减少。结论 饮用绿茶可能部分通过拮抗血浆和血管组织局部的AngⅡ系统效应而产生抑制大鼠血管组织钙化的作用。
【关键词】 绿茶 大鼠 血管钙化 血管紧张素Ⅱ
Abstract：Objective To explore the possible mechanism which was involved in the regulatory action of green tea on vascular calcification. Methods Rat vascular calcific model was made by vitamin D3 intramuscular injection and oral nicotine. Rats were pided into four groups：the control，the calcification，lower and higher dosage green tea groups. The total aorta Ca2+ content in aorta was measured by atom absorptive spectrophotography；the alkaline phosphatase(ALP)activity in plasma and aorta；and the levels of osteocalcin(OC)，angiotensin II(Ang Ⅱ)in plasma and aorta were determined by radioimmunoassay. Results A large number of lack granules among the smooth muscle cells and its matrix in calcified aorta by Von Kossa staining in VDN group was observed. More calcium contents，ALP and OC were observed in VDN group than that in control group. AngⅡ level of aortic was significantly increased. The calcification in aorta was significantly attenuated by drinking with green tea 50 g/L and 100 g/L for 6 weeks，and the latter dosage was more potent than the former. After the geen tea treatment，the total aorta Ca2+ contents，ALP activity，and OC levels were less respectively than those in rats with vascular calcification.Green tea treatment significantly decreased AngⅡ level. Conclusion The results indicated that green tea could significantly attenuate the calcification in rat aorta partly through the antagonism with AngⅡ system in circulation and vascular tissues. group
Key words：green tea；rat；vascular calcification；angiotensin II
血管钙化损伤心血管功能，导致血栓形成、粥样硬化斑块破裂等严重后果，是心血管事件(心肌梗死和脑卒中等)的重要危险因子，也是导致血管性疾病的死亡及致残的重要原因［1］。有报道，绿茶可以作用于动脉粥样硬化形成和进展过程的各个环节，延缓动脉粥样硬化的形成和发展，降低动脉粥样硬化的危险，具有抗炎、降血脂、抗氧化、清除自由基及抑制脂质过氧化，防治心脑血管疾病等多种功效［2-3］。且绿茶能够抑制由血管紧张素Ⅱ(angiotensin II，AngⅡ)诱导的c-Jun mRNA的表达，使c-Jun氨基端激酶(JNK)的激活受阻，从而抑制由AngⅡ刺激产生的血管平滑肌细胞肥大，防治心血管疾病(高血压、动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄等)［4］。但绿茶与血管钙化之间的关系尚未见报道。本研究在大鼠血管钙化的模型上，观察饮用绿茶对血管钙化的影响，以探讨绿茶对血管钙化的作用及其可能机制。
1 材料与方法
1.1 材料
雄性Sprague-Dawley大鼠180～200g，由宁夏医学院实验动物中心提供。尼古丁购自Sigma公司；维生素D3购自上海通用药材有限公司；绿茶购自浙江省东阳市东白山茶场；大鼠骨钙素、血管紧张素Ⅱ放免试剂盒购自北京科美东雅生物技术有限公司；碱性磷酸酶测试盒购自南京建成生物技术有限公司；其余试剂均为市售分析纯。
1.2 大鼠血管钙化模型的制备
参照文献［5］方法制备大鼠血管钙化模型。24只大鼠随机分为4组(每组6只)：①钙化组(VDN)：维生素D3(300 000 IU/kg)肌肉注射，同时尼古丁(25 mg/kg 溶于花生油)灌胃，9h后尼古丁重复灌胃1次，每天予凉白开水自由饮水；②钙化＋低剂量绿茶组(VDN+TL，简称低剂量组)：在钙化处理的基础上，每天予以饮用50 g/L的新鲜绿茶(绿茶50g/L，自来水煮沸后温度降至80～90℃，于玻璃烧杯中泡制15min)，连续自由饮茶6周；③钙化＋高剂量绿茶组(VDN+TH，简称高剂量组)：处理方法同②，绿茶浓度为100 g/L；④对照组：操作同①，肌肉注射生理盐水和单纯花生油灌胃。
各组大鼠常规饲养，定期称重，监测饮水量，钙化处理6周后乌拉坦1 g/kg腹腔注射麻醉，心脏取血，肝素抗凝，分离血浆，-70℃冻存备用。摘取全长胸腹主动脉，取5 mm升主动脉用10％中性福尔马林固定，用于组织学观察，其余部分作下述测定。
1.3 血管组织总钙含量测定［6］
取胸主动脉(约10mg)80℃烤干，加入2mol/L 硝酸0.5mL，180℃消化并烤干，冷却后加入去离子水(含27nmol/L 的氯化钾和27μmol/L 的氯化镧)10 mL复溶，取2 mL加入1 %氯化锶100μL，原子吸收分光光度计(Jena，novAA300)在422.7nm 处读取吸光度，测定组织的钙含量。
1.4 血浆及血管组织碱性磷酸酶(ALP)活性测定
约10 mg胸主动脉，以等渗PBS 制备组织匀浆，4 ℃ 8000×g离心10 min，吸取上清液，以考马斯亮蓝法行蛋白定量。按照ALP 测定试剂盒说明书，采用磷酸苯二钠(金氏)法测定ALP 活性。
1.5 血浆及血管组织骨钙素(OC)和AngⅡ浓度测定
主动脉用PBS 匀浆离心后，按照试剂盒说明书，采用放射免疫法测定血浆及主动脉骨钙素的浓度和AngⅡ浓度。
1.6 Von Kossa染色［6］
血管组织进行石蜡包埋、切片，常规脱蜡、脱水后浸入5%的硝酸银溶液中，在日光下照射60 min，再用2.5%的硫代硫酸钠溶液处理5 min，然后依次用碱性品红复染，经脱水、透明、封固，在光镜下观察。
1.7 统计学方法
数据以均数±标准差表示(±s)，两样本均数间比较采用t检验，多样本均数间比较采用One-way ANOVA检验，组间的两两比较采用Student-Newman- Keuls(SNK)方法检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠血管钙化特征
血管Von Kossa 染色见钙化组血管，尤其是中膜弹性纤维间有大量黑色颗粒，沉积于细胞外基质和平滑肌细胞内，部分聚集成团并形成钙结节，表明存在钙沉积；正常组血管未见黑色颗粒(图1，见封3)。钙化组大鼠主动脉ALP 活性、OC浓度和钙含量分别较对照组高2.83倍、84.12％和1.98倍；钙化组大鼠血浆ALP 活性和OC 浓度分别较对照组高1.89倍和93.02％(P＜0.01)，见表1。
2.2 绿茶减轻大鼠血管钙化作用
与钙化组相比较，低和高剂量绿茶干预后大鼠血管中膜弹力纤维的黑色颗粒明显减少，无明显钙结节形成，表明明显减轻了血管组织的钙沉积，且高剂量效应强于低剂量(图1，见封3)。与单纯钙化组相比较，低剂量组大鼠主动脉ALP 活性、OC 浓度和钙含量分别低7.60％(P＞0.05)、12.43％和24.09％(P＜0.05)；血浆ALP 活性和OC 浓度分别低23.92％和16.87％(P＜0.01)；高剂量组大鼠主动脉ALP 活性、OC 浓度和钙含量分别低26.94％、24.33％和30.19％(P＜0.01)；血浆ALP 活性和OC 浓度分别低47.19％和28.92％(P＜0.01)。高剂量组较低剂量组大鼠主动脉ALP 活性和OC 浓度分别低20.94％和13.59％(P＜ 0.05)；血浆ALP 活性和OC 浓度分别低30.58％(P＜0.01)和14.49％(P＜0.05)；而高、低剂量组间血管钙含量无统计学意义(表1)。表1 血浆碱性磷酸酶、骨钙素及主动脉碱性磷酸酶、骨钙素和钙含量的变化(略)
2.3 绿茶对血管钙化大鼠血浆及主动脉AngⅡ水平的影响
钙化组大鼠血浆及主动脉AngⅡ水平分别较对照组高108.17％和69.10％(P＜0.01)。低剂量和高剂量干预后的钙化组大鼠血浆AngⅡ含量分别较单纯钙化组降低16.48％(P＜0.05)和27.52％(P＜0.01)；主动脉AngⅡ含量分别降低11.60％(P＞0.05)和20.08％(P＜0.05)。而高、低剂量组之间，血浆和主动脉AngⅡ含量差异均无统计学意义(表2)。表2 血浆、主动脉AngⅡ含量的变化(略)
3 讨论
血管钙化的确切机制目前尚未阐明，可能与钙磷代谢失衡、血管局部调节因子(如AngⅡ、肿瘤坏死因子-α、内皮素、尾加压素Ⅱ等)、氧自由基、趋钙激素等多种因素作用于血管组织有关；而且钙化的血管平滑肌细胞(VSMCs)的表型发生转变，细胞特征消失，功能紊乱，导致心血管功能失衡。
大剂量维生素D3可造成动脉组织钙沉积，尼古丁可增强维生素D3的反应，二者合用可导致动物心血管组织钙过度负荷模型。本实验观察到给大鼠肌注维生素D3和尼古丁灌胃6周后，大鼠主动脉组织及血浆ALP活性、OC 及钙含量显著高于对照组大鼠，血管Von Kossa染色呈典型钙化结节，血管明显钙化，与文献报道一致［5］。经绿茶干预后，血管组织钙化指标均下降，Von Kossa染色显示血管钙化结节减轻，且血管钙化程度呈浓度依赖性减轻，提示绿茶具有抑制血管钙化的作用。
血管钙化时血管组织及细胞旁/自分泌功能的变化以及这些变化在血管钙化发生和发展中的意义，目前均不清楚。AngⅡ可在血管局部产生，主要与血管平滑肌细胞膜上的AT1受体结合，具有强的收缩血管、促进VSMC 增生肥大、促进细胞外基质合成和黏附分子的释放和表达等作用［7］。AngⅡ可以影响血管内皮细胞、单核/巨噬细胞和平滑肌细胞、促进血管新生、影响脂质代谢等多方面参与动脉粥样硬化病理过程［8］。对血管重塑具有重要的调节作用，是动脉粥样硬化等心血管疾病的重要致病因素。研究还发现［9］：一定浓度的AngⅡ可以增加骨形成蛋白(BMP-2)表达，增加丙二醛(MDA)，降低超氧化物歧化酶(SOD)的水平。文献［9］报道，AngⅡ促进血管钙过负荷和诱导VSMC向成骨细胞表型转化，表明AngⅡ过表达是促进血管钙化发生的重要因素之一。本实验研究发现，血管钙化大鼠血管组织及血浆AngⅡ含量明显升高，与文献报道一致［10］，表明AngⅡ参与血管钙化的发生、发展；予以绿茶干预后的钙化组大鼠血浆和血管AngⅡ含量明显减少，提示绿茶对血管钙化的拮抗效应可能与下调体内AngⅡ表达有关。
本实验观察到不同浓度的绿茶可明显减轻大鼠钙化模型的钙化程度。本实验还观察到血管钙化时血浆和血管组织AngⅡ含量增加，而给予绿茶使血浆和血管组织的AngⅡ下调，提示绿茶抑制钙化的效应可能部分与干预血浆和血管组织的AngⅡ系统有关。
参考文献
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