虾青素对小鼠急性乙醇肝损伤的保护作用

【摘要】 目的： 研究虾青素对乙醇所致小鼠急性化学性肝损伤的保护作用。方法： 雄性小鼠60只，随机分为正常对照组、急性乙醇肝损伤模型组、联苯双酯阳性对照组(15 mg/kg)以及虾青素低、中、高剂量组(10，15，20 mg/kg)共6组。测定并比较各组小鼠肝脏系数，血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶（GSHpx）活性与丙二醛(MDA)含量；测定肝组织中SOD，GSHpx活性，MDA含量以及组织病理系数。结果： 各剂量虾青素均能升高急性乙醇肝损伤小鼠血清与肝组织中SOD，GSHpx活性(P&<0.01)，降低血清ALT，AST活性(P&<0.01)，降低血清与肝组织MDA含量(P&<0.01)，并能不同程度地改善肝脏病理组织损伤。结论： 虾青素对乙醇所致急性肝损伤具有预防性保护作用。

【关键词】 虾青素； 乙醇肝损伤； 抗氧化

　　［Abstract］ Objective: To study the protective effects of astaxanthin against the acute alcohol liver injury in mice and research its possible mechanism for offering scientific basis of its health function. Methods： Randomly to distribute 60 male mices to control group， acute alcohol liver injury model group， DDB group(15 mg/kg) and low， middle， high dose group s of astaxanthin(10， 15， 20 mg/kg)， and to determine and compare liver index between groups， with serum alanine transaminase(ALT)，aspartate transaminase(AST)，superoxide dismutase(SOD)，glutathione perioxidase(GSHpx) activities，malondialdehyde(MDA) content， liver SOD，GSHpx activities，MDA content and liver tissue pathology index to be assayed. Results： Treatment with different dose astaxanthin could significantly increase serum and liver tissue SOD，GSHpx activities(P&<0.01)， decrease serum ALT，AST levels(P&<0.01) and MDA content in liver tissue(P&<0.01). Pathology index showed that astaxanthin could ameliorate the liver injury in different degree. Conclusion： Astaxanthin showed protective effects on the acute alcohol liver injury induced by alcohol in mice.

　　［Key words］ astaxanthin; alcohol liver injury; antioxidant

　　乙醇性脂肪肝(alcoholic fatty liver disease，AFLD)是指由于乙醇摄入过量而导致的肝脏一系列损害病变。肝脏中过量的乙醇及其氧化代谢产物可诱导肝细胞微粒体酶细胞色素P450系统活性，特别是与乙醇代谢有关的高活性氧化代谢酶CYP2E1活性升高，进而通过CYP2E1的氧化代谢产生大量活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)。ROS具有极强的氧化攻击特性，可直接攻击细胞器、DNA及具有重要功能的蛋白信号因子，导致肝细胞损伤及肝功能异常等［1］。
　　
　　虾青素是一种类胡萝卜素，主要以全反式异构体形式存在于海洋动物体、藻体及多数陆生植物体内并具有多种生物学功能，如抗氧化、防止心血管疾病、提高免疫力和抗癌等作用，其中总抗氧化能力为维生素E的近20倍［2］。
　　
　　随着虾青素消费市场的不断扩展，国内外研究机构开始集中围绕其预防与治疗疾病潜在机理进行探索性研究，目前尚未见有关虾青素对急性乙醇肝损伤影响的报道。为此本实验就这一问题进行了初步的研究工作。
　　
　　1 材料与方法

　　1.1 主要仪器和试剂
　　
　　Labconco冰冻真空干燥仪（法国乐高公司），752分光光度计，AE100电子天平（中国伯乐公司），电热三用水箱，KA1000型台式离心机（中国杭州华亭公司），960型荧光分光光度计，J2SH高速冰冻离心机（日本岛津公司），C30柱（YMC Carotenoid S5，Waters），HPLC（Waters 600E溶剂输送系统，PDA2996二极管阵列检测器Waters），联苯双酯（北京协和制药厂），丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化酶（GSHpx）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所），全反式虾青素乳化颗粒（瑞士罗氏DMS公司），乙腈、甲醇、甲基叔丁基醚（MTBE）（美国迪马公司），无水乙醇（北京化学试剂公司），大孔吸附树脂（天津农业股份公司）。
　　
　　1.2 乳化剂破乳制备虾青素

　　1.2.1 有机萃取 称取10 g乳化颗粒加入少许水，超声波促溶后，加入300 ml丙酮-正己烷萃取。静置2 h后，将脂溶性相收集（反复萃取直至水相成无色）。再利用减压旋转蒸发仪进行提取液浓缩处理。

　　1.2.2 虾青素提取液柱色谱纯化 （1）装柱 将活化好的氧化铝装填于玻璃层析柱中，装填高度为12 cm，用正己烷润湿。（2）洗脱 分别取2 ml虾青素提取液上柱，用50 ml正己烷-丙酮淋洗，收集洗脱液。将洗脱液用氮气吹干制粉，装入充满氮气的玻璃瓶内，-70℃储存备用。

　　1.3 虾青素鉴定
　　
　　参照全反式虾青素标准品，根据其HPLC中保留时间和紫外可见吸收光谱的特征峰进行鉴定。得到的虾青素提取液经过过滤后用高效液相色谱分离。色谱柱：Waters YMC Carotenoid S5(4.6 mm×250 mm)；流动相A：乙腈-甲醇（75∶25）;流动相B：MTBE；流动相A与B中分别加入0.05%三乙胺作为改性剂防止虾青素降解；线性梯度洗脱：B在8 min内由0%增加至55%；8～35 min B维持55%；35～40 min B由55%减至0%；流速1.0 ml/min;检测波长： λ/nm=475；波长范围260～700 nm；进样量20 μl。收集后观察其光谱特征峰行为［3］。色谱和光谱分析结果表明实验所用灌胃物为全反式虾青素，纯度为95%。

　　1.4 动物实验

　　1.4.1 乙醇诱导动物急性肝损伤模型的建立 将60只小鼠（购自中国军事医学科学院实验动物养殖中心，医动字第07231号）随机分组，设空白对照组、急性乙醇肝损伤模型组、联苯双酯组(15 mg/kg水溶混悬液)、虾青素高剂量(20 mg/kg) 、虾青素中剂量(15 mg/kg)、虾青素低剂量组(10 mg/kg)共6组，每组10只。按体质量20 ml/kg用联苯双酯和不同剂量的虾青素分别给相应各组灌胃，每天1次。正常组与模型组每天灌服等体积的纯净水，连续14 d。最后一次用药1 h后造模，除空白对照组外，其余5组小鼠均腹腔注射50%乙醇溶液，剂量为10 ml/kg；空白对照组同法腹腔注射等量的水，禁食(自由饮水)，16 h后各组经眼球后静脉丛取血，3 000 r/min离心10 min分离血清，测定各组血清中ALT，AST，SOD，GSHpx，MDA水平。开胸后，取肝脏，用4 ℃生理盐水冲洗，滤纸吸干，称重，计算肝脏系数。脏器系数(%)=脏器质量(g)/体质量(g)×100%。取肝右叶相同部位的一小块肝组织，以4℃生理盐水制成10 %肝匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清，测定各组肝组织SOD，GSHpx，MDA；取肝左叶标本浸于4%的甲醛溶液中固定，切片，苏丹Ⅲ染色5 min，甘油明胶封固，评估肝脏的脂肪变性情况。

　　1.4.2 生化指标测定 ALT，AST水平测定采用赖氏法;MDA含量测定采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法；SOD活性测定采用亚硝酸盐法；GSHpx活性测定采用5，5双硫代对硝基苯甲酸（DTNB）显色法。

　　1.4.3 肝脏组织病理学检查 评估肝脏的脂肪变性情况，评分标准为，0分：肝细胞内脂滴散在，稀少；1分：含脂滴的肝细胞不超过1/4(散在分布)；2分：含脂滴的肝细胞不超过1/2(散在分布)；3分：含脂滴的肝细胞不超过3/4(弥散分布)；4分：肝组织几乎被脂滴代替(波及整个肝组织切片)。

　　1.4.4 统计处理 所有数据用均数±标准差（±s）表示，用SPSS10.0统计软件进行统计，组间差异比较用单因素方差分析，P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 各组小鼠血中相关生化指标及肝重系数
　　
　　与正常对照组比较，急性乙醇肝损伤模型组小鼠血中SOD，GSHpx活性显著降低(P&<0.01)，而ALT，AST活性，MDA含量和肝重系数显著增加(P&<0.01)。与急性乙醇肝损伤模型组比较，虾青素各剂量组和联苯双酯组血中SOD，GSHpx活性明显升高，ALT，AST活性，MDA含量和肝重系数明显降低(P&<0.01)。与虾青素低剂量组比较，虾青素中、高剂量组SOD，GSHpx活性升高(P&<0.01)，ALT，AST活性，MDA含量和肝重系数降低(P&<0.01)。与中剂量组比较，虾青素高剂量组SOD，GSHpx活性升高(P&<0.01)，ALT，AST活性和MDA含量降低(P&<0.01)，显示出一定的剂量反应关系（表1）。

　　2.2 各组小鼠肝脏相关生化指标及组织脂肪变性评分
　　
　　与正常对照组比较，急性乙醇肝损伤模型组小鼠肝脏SOD，GSHpx活性显著降低(P&<0.01)，而MDA含量显著增加(P&<0.01)。与急性乙醇肝损伤模型组比较，虾青素各剂量组和联苯双酯组小鼠肝脏组织中SOD，GSHpx活性明显升高，MDA含量明显降低(P&<0.01)。与虾青素低剂量组比较，虾青素中、高剂量组SOD，GSHpx活性升高(P&<0.01)，MDA含量降低(P&<0.01);与中剂量组比较，虾青素高剂量组SOD，GSHpx活性升高(P&<0.01)，MDA含量降低(P&<0.01)，显示出一定的剂量反应关系。此外，虾青素各剂量组小鼠肝脏病理组织检查评分均明显低于急性乙醇肝损伤模型组(P&<0.01)，见图1。
　　
　　表1 各组小鼠血清中SOD， GSHpx， ALT， AST活性和MDA含量（略）

　　Tab 1 SOD，GSHpx， ALT， AST activity and MDA content in mice serum

　　a: P&<0.01，与对照组相比；b:P&<0.01， 与模型组相比；c:P&<0.01，与联苯双酯组相比；d:P&<0.01，与低剂量组相比；e:P&<0.01， 与中剂量组相比
　　
　　表2 各组小鼠肝脏组织中SOD，GSHpx活性，MDA含量和病理组织脂肪变性评分（略）

　　Tab 2 SOD，GSHpx activity， MDA content and pathology index in mice liver

　　a:P&<0.01， 与对照组相比；b：P&<0.01，与模型组相比； c：P&<0.01，与联苯双酯组相比； d：P&<0.01，与低剂量组相比；e：P&<0.01，与中剂量组相比
　　
　　3 讨论
　　
　　各种有害因素所致的肝损伤可表现为肝坏死、脂肪肝、胆汁淤积、肝纤维化、肝硬化及肝癌等，对肝损伤的防治目前仍是一个全球性的严峻课题。因此通过建立实验性肝损伤动物模型，研究肝病的发生机制，筛选保肝药物，探索保肝作用原理，具有重要的现实意义。乙醇对肝损伤的毒性作用是通过脂质过氧化作用进行的。乙醇在代谢中激活的氧自由基，可与肝细胞内大分子发生共价结合，也可使肝细胞膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，从而损伤肝细胞膜的结构和功能，使膜通透性升高，导致细胞肿胀坏死［4-6］。
　　
　　乙醇氧化产生的乙醛具有毒性作用，可抑制烷基化核蛋白的修复，降低肝酶的活性；同时，乙醇的长期摄入显著降低了线粒体的氧利用率。反过来，线粒体氧化容量的受损也会干扰乙醛的氧化，从而形成恶性循环，导致乙醛逐渐累积并加重线粒体的损伤。而且，乙醛可以减少还原型谷胱甘肽(GSH)的浓度，引起脂质过氧化反应，增加自由基的毒性作用，促进细胞凋亡。乙醛结合微管上的微管蛋白，阻碍蛋白质的分泌，形成的乙醛-蛋白促使胶原产生，可以作为肿瘤抗原，刺激免疫反应发挥作用，诱导炎症的产生。此外有研究显示，乙醇可以诱导肝细胞内转移生长因子α(TGFα)的产生，从而刺激了肝星状细胞的胶原合成，促进肝脏纤维化的进展［7-9］。
　　
　　当机体摄入乙醇时，可以显著影响血清ALT，AST活性。同时体内肝组织细胞中的自由基代谢平衡就会失调，对自由基的防御能力也会下降，过量自由基可使生物膜脂质双分子层中的不饱和脂肪酸过氧化，而形成脂质过氧化产物，从而使膜结构和功能发生障碍。过氧化脂质的代谢产物MDA进一步与磷脂酰乙醇胺和蛋白质交联，生成无活性脂褐质，沉积于组织细胞，破坏细胞膜结构，最后导致细胞无法维持正常代谢而死亡［10］。本实验的结果表明，与模型组比较，虾青素各剂量组血清与肝脏组织中MDA含量均明显减少，说明虾青素可以促使乙醇所致急性肝损伤模型小鼠MDA含量的升高。
　　
　　SOD是机体内清除自由基的重要抗氧化酶之一，乙醇的摄入使其活性减弱，引起不饱和脂肪酸氧化生成过氧化物，形成脂褐质，过氧化物可使DNA、蛋白质和酶等改变、破坏，从而加速肝脏损伤［11］。本实验结果表明，与模型组比较，虾青素各剂量组小鼠血清与肝脏组织中SOD活性均明显增强。由此可推断虾青素可以抑制乙醇所致急性肝损伤模型小鼠SOD活性的降低。GSHpx是机体内广泛存在的一种含硒抗氧化酶，可通过特异性催化GSH对氢化氧化物的还原反应，而消除细胞内有害的过氧化代谢产物，以阻断脂质过氧化连锁反应，从而对保护细胞代谢的正常进行起到重要作用。随着机体乙醇摄入的增多，体内自由基水平的不断增加，GSHpx的活性会降低［12］。本实验结果表明，与模型组比较，虾青素各剂量组小鼠血清与肝脏组织中GSHpx活性均明显增强。由此可推断虾青素可抑制乙醇所致急性肝损伤模型小鼠GSHpx活性的降低。
　　
　　综上所述，本实验结果表明虾青素可以降低血清ALT，AST活性和肝脏组织中MDA含量，升高血清与肝组织中SOD，GSHpx活性，并降低肝细胞脂肪堆积，有效缓解乙醇对肝脏组织的损伤。联苯双脂作为目前治疗临床慢性病毒性、黄疸性肝炎的常见药物，具有较好的治疗效果，但长期服用会产生肝肾毒副作用［13，14］，实验表明虾青素可能通过抗氧化途径改善乙醇性肝损伤，虽作用效果不如联苯双脂，但没有任何毒副作用。因此虾青素有可能逐渐成为一种选择性的辅助药物运用于此类肝损伤的治疗与预防。

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