反义caveolin1对实质肿瘤细胞中β3半乳糖基转移酶7表达的调节作用

　　 作者：秦芳， 杨玲焰， 姜智， 吴祁生， 徐岚， 闫石， 杨世蕊， 吴士良

【摘要】 目的： 研究反义caveolin1对实质肿瘤细胞中β3半乳糖基转移酶7（β3GalT7）表达的调节，以期阐明caveolin1与β3GalT7的相关性。方法： 运用脂质体介导转染人工合成的caveolin1反义核苷酸（ASODN）至人类4种实质肿瘤细胞中，通过荧光显微镜、RTPCR及蛋白质印迹检测β3GalT7表达的变化。结果： 转染反义caveolin1后的4种实质肿瘤细胞中β3GalT7均有明显的增强。结论： 表明caveolin1调节肿瘤细胞中β3GalT7的表达，且与β3GalT7的表达呈负相关。

【关键词】 β3半乳糖基转移酶7； caveolin1； 反义核苷酸； 肿瘤细胞

　　［Abstract］ Objective: To research the modulation of the downregulation of caveolin1 to β3GalT7 in human parenchyma tumor cells.Methods： By means of the transfection to transfect the ASOND to four parenchyma tumor cells to detect the expression of β3GalT7. Results： The expression of β3GalT7 had been raised in the four cells after transfection of ASODN. Conclusion： Caveolin1 had a minus relationship with β3GalT7.

　　［Key words］ β3GalT7； caveolin1； ASODN； tumor cells

　　多种肿瘤(如前列腺、乳腺、口腔等的肿瘤)的发生均与染色体7q31.1区内染色体缺失有关，编码caveolin1的基因就位于7q31.1，推测caveolin1可能对正常细胞的恶性转化和恶性增殖有抑制作用。caveolin1由Clenney等发现，相对分子质量21 000～24 000，长178AA，其编码基因定位于7q31.1，有3个外显子。caveolin1与细胞的恶性转化、恶性增殖、侵袭、转移以及信号传导有关，逐渐受到人们关注。多数事实支持caveolin1是一种抑制肿瘤蛋白。用反义caveolin1致使caveolin1表达下调，并使NIH3T3细胞发生转化，caveolin1表达显著降低［1］。Wu等［2］研究表明，人类结肠癌细胞株和结肠癌组织中caveolin1的表达均下降，可能归因于同时检测到的caveolin1 mRNA水平下调。用蛋白质印迹法发现，无论在结肠黏膜还是间质，肿瘤组织的caveolinl水平都明显低于正常。同时将caveolin1重组表达于HT29和DLD1结肠癌细胞系，并将两种细胞注入裸鼠，观察肿瘤形成情况，与未转染的亲代细胞相比，转染细胞系形成的肿瘤生长缓慢、体积小，甚至检测不到。而且实验人员将裸鼠体内形成的肿瘤细胞进行体外培养，发现与已转染而未注入裸鼠的亲代细胞相比， caveolin1水平下降，提示caveolin1表达在细胞恶性转化、恶性增殖的过程中下调，这可能是肿瘤发生过程中一个普遍存在的现象。国外也有研究报道反义caveolin1可使β3GnT3的表达有明显提高，而对β3GnT5的作用不甚显著。但是近年来研究发现某些肿瘤组织中caveolin1呈高表达。如何解释caveolin1在肿瘤发生过程中这两种完全相反的作用呢?本文通过人工合成caveolin1的反义核苷酸(ASODN)，转染人实质性肿瘤细胞，研究caveolin1与β3半乳糖基转移酶7（β3GalT7）的相关性，以期为将来的深入研究打下基础。
　　
　　1 材料和方法

　　1.1 材 料
　　
　　人喉癌细胞株Hep2、人肺腺癌细胞株A549、人肝癌细胞株HepG2和人胃癌细胞株SGC7901均为本实验室保存。小牛血清购自上海华美生物公司；RPMI1640完全培养基：每升RPMI1640基础培养基（Gibco，美国）中，添加小牛血清100 ml，L谷氨酰胺0.292 g，NaHCO3 2.0 g，葡萄糖3.6 g，HEPES（Amresco，进口分装 ）2 g；胰蛋白酶购自Sigma公司；DEPC购自上海华舜生物工程公司；Oligo(dT)，Trizol，RNase Inhibitor，Suoercript IIRNase H Reverse transcriptase，Taq DNA聚合酶，dNTP Mix（10 mmol/L），10×PCR 缓冲液，MgCl2（25 mmol/L）购自Promega公司；琼脂糖，Mix DNA 标准参照物购自南京大治公司；Liprofectamine 2000购自Invitrogen公司。β3GalT7多克隆抗体由本实验室制备，MMP2抗体购于Sigma公司。

　　1.2 反义核苷酸的人工合成
　　
　　caveolinl反义核苷酸序列为5′ATGTCCCTCCGAGTCTA3′，经基因库同源性检测，未发现与人类其他基因序列有同源性，命名为CAV1。反义核苷酸序列由南京基天生物工程公司合成，全部碱基硫代磷酸型，在5′端用绿色荧光蛋白FITC标记，PAGE 纯化，冻干分装， -20 ℃保存，应用时以无菌双蒸水溶解。以反义核苷酸打乱顺序序列5′ATCACCGTCGGTCTCTAT3′作为阴性对照，命名为CAVD。

　　1.3 寡核苷酸转染细胞
　　
　　将处于对数生长期的4种肿瘤细胞接种于培养瓶(1×106/ml)，于37℃ 5%CO2培养箱中温育12 h后，按2 000介导转染贴壁细胞的方法，将反义核苷酸和阴性对照转染入细胞，48 h后收集。

　　1.4 荧光成像系统观测
　　
　　将细胞置于荧光显微镜下，激发光波长为507 nm观察。

　　1.5 细胞收集培养
　　
　　人喉癌细胞株Hep2，人肺腺癌细胞株A549，人肝癌细胞株HepG2，人胃癌细胞株SGC7901单层培养于 37 ℃，5 %CO2饱和湿度培养箱中，采用0.25%胰酶消化，以消化传代后处于对数生长期的细胞备用。

　　1.6 RTPCR
　　
　　分别收集这4种细胞株对数生长期的细胞，进行反转录PCR分析。以βactin为内对照，分别检测4种细胞caveolin1和β3GalT7的mRNA表达水平。选用βactin为内对照，以总RNA的RT产物为模板同时进行PCR扩增，PCR反应条件是94℃预变性4 min，94℃变性50 s，59℃退火50 s，72℃延伸90 s，32个循环，72℃再延伸10 min。设计引物采用Genetyx软件，并经基因库Blast进行同源检索后合成。引物由Invitrogen公司合成。
　　
　　1.7 蛋白质印迹检测肿瘤相关指标
　　
　　用蛋白质印迹(按分子克隆操作，化学显色法显示杂交条带，洗片机洗片，数码相机拍照记录结果)检测4种实质肿瘤细胞β3GalT7表达的变化。

　　2 结果

　　2.1 转染caveolin1反义核苷酸的CAV1和阴性对照CAVD后的荧光检测
　　
　　转染caveolin1反义核苷酸的CAV1和阴性对照CAVD后检测可见荧光，转染效率较高，达到80%以上，见图1。

　　2.2 转染前后4种细胞株β3GalT7和caveolin1的mRNA表达变化情况
　　
　　在这4种实质肿瘤细胞中，β3GalT7和caveolin1均有表达。转染caveolin1反义核苷酸后的4种细胞株β3GalT7和caveolin1的mRNA表达情况与未转染前相比，β3GalT7的mRNA表达有明显增加，阴性对照组变化不大；转染caveolin1反义核苷酸CAV1后，caveolin1的表达明显降低，抑制效率达90%以上，阴性对照组变化不大。见图2～图4。

　　2.3 转染前后4种细胞株β3GalT7蛋白水平表达情况
　　
　　4种肿瘤细胞中β3GalT7蛋白也有不同程度的表达。转染caveolin1反义核苷酸的4种细胞株β3GalT7蛋白水平表达情况，与未转染前相比，β3GalT7的蛋白表达有明显增加。见图5。

　　1：人胃癌细胞株SGC7901；2：人肺腺癌细胞株A549；3：人喉癌细胞株Hep2；4：人肝癌细胞株HepG2

　　图2 转染前后4种细胞株β3GalT7和caveolin1的表达变化情况（略）

　　Fig 2 Different mRNA expression of β3GalT7 and caveolin1 in the four tuorm cells with and without the transfection

　　1：人胃癌细胞株SGC7901；2：人肺腺癌细胞株A549；3：人喉癌细胞株Hep2；4：人肝癌细胞株HepG2

　　图3 转染前后caveolin1 mRNA水平表达变化（略）

　　Fig 3 Expression of caveolin1 mRNA before　and after transfection

　　1：人胃癌细胞株SGC7901；2：人肺腺癌细胞株A549；3：人喉癌细胞株Hep2；4：人肝癌细胞株HepG2

　　图4 转染前后β3GalT7 mRNA水平表达变化（略）

　　Fig 4 Expression of β3GalT7 mRNA before andp　after transfection

　　1：人喉癌细胞株Hep2； 2：人胃癌细胞株SGC7901；3：人肺腺癌细胞株A549；4：人肝癌细胞株HepG

　　图5 转染前后4种细胞株β3GalT7蛋白水平表达情况（略）

　　Fig 5 With and without transfection of CAV1 ， the protein expression of β3GalT7 in the four tuorm cells

　　3 讨论
　　
　　人编码caveolin1蛋白的基因位于7q31.1，该基因座位经常在肿瘤的发生过程中丢失，故被很多学者认为是一种候选的抑癌基因［3］。有研究表明［4-8］，乳腺癌细胞比正常乳腺细胞caveolin1的表达减少，当把caveolinl的cDNA转染进这些细胞后发现肿瘤生长得到抑制；通过对胃乳头状腺癌、管状腺癌、印戒细胞癌等56例胃癌组织及29例非癌胃黏膜进行分析发现，caveolin1在胃上皮细胞中的表达水平随着胃癌的发生和发展而呈进行性下调乃至缺失；67％的结肠癌患者结肠黏膜中caveolin1的表达下降，结肠癌细胞系HT29和DLDl中caveolinl的mRNA和蛋白均下调，而将caveolin1转染进这两种癌细胞后，其在裸鼠体内的成瘤率明显降低；在卵巢癌上也发现了相似的结果，即在卵巢癌细胞系及卵巢癌标本中检测到caveolin1表达的下降，将caveolin1基因转染入卵巢癌细胞系OVCAR3后出现肿瘤细胞生长的抑制；在caveolin1表达比较高的肝外胆管癌患者预后较好。直到1995年发现在NIH 3T3细胞癌变后caveolin1表达减少，细胞膜上的caveolin也几近消失。此后，越来越多的学者展开了caveolin1与肿瘤发生发展关系的研究，然而，这一问题到目前还存在很大的分歧［9］。
　　
　　在本课题组前面的工作中，我们已经了解到，β3GalT7与肿瘤的浸润转移有关，且在人肺腺癌细胞株A549、人喉癌细胞株Hep2、人肝癌细胞株HepG2和人胃癌细胞株SGC7901中均有中高度的表达［10］，故选用这几种细胞株作为研究材料。通过RTPCR和蛋白质印迹检测转染反义核苷酸组和对照组β3GalT7 mRNA和蛋白的表达情况，结果显示转染组的β3GalT7表达相比于对照组升高。
　　
　　以上实验证明，当caveolin1受到抑制或沉默的时候，β3GalT7在mRNA和蛋白水平的表达则升高，可见，β3GalT7的表达的确与caveolin1的表达之间存在着一种负相关的关系。但是，对于β3GalT7直接受到caveolin1调控的证据还有待于进一步的研究。由于β3GalT7是我们实验室得到的一个新的基因，目前对这个基因的认识还处于起步阶段，对于β3GalT7是否受到转录因子的调控也没有任何数据可以参考，而且考虑到经费和时间的因素，故本文采用了较简单的手段来进行研究，以期起到投石问路的作用。
　　
　　（本文图1见彩色插图）（略）

参考文献

　　［1］ Bender FC， Reymond MA， Bron C， et a1. Caveolin1 levels are downregulated in human colon tumors， and ectopic expression of caveolin1 in colon carcinoma cell lines reduces cell tumorigenicity［J］.Cancer Res， 2000，60(20):5870-5878.

　　［2］ Wu D， Foreman TL， Gregory CW， et al. Protein kinase cepsilon has the potential to advance the recurrence of human prostate cancer［J］. Cancer Res，2002， 62(8)：2423-2429.

　　［3］ Parton RG. Caveolaefrom ultrastructure to molecular mechanisms［J］. Nat Rev Mol Cell Biol，2003，4(2):162-167.

　　［4］ 高 雪，孙 媛，黄 磊，等. caveolin1在胃癌组织中的表达及临床生物学意义［J］.癌症，2005，24(3):311-316.

　　［5］ Cohen AW， Park DS， Woodman SE， et al. Caveolin1 null mice develop cardiac hypertrophy with hyperactivation of p42/44 MAP kinase in cardiac fibroblasts［J］. Am J Physiol Cell Physiol， 2003，284(2):C457-C474.

　　［6］ Bender FC， Reymond MA， Bron C， et al. Caveolin1 levels are downregulated in human colon tumors， and ectopic expression of caveolin1 in colon carcinoma cell lines reduces cell tumorigenicity. ［J］. Cancer Res， 2000， 60(20): 5870-5878.

　　［7］ Engelman JA， Lee RJ， Karnezis A， et al. Reciprocal regulation of neu tyrosine kinase activity and caveolin1 protein expression in vitro and in vivo. Implications for human breast cancer［J］. J Biol Chem， 1998， 273(32): 20448-20455.

　　［8］ Vanaja DK， Mitchell SH， Toft DO， et al. Effect of geldanamycin on androgen receptor function and stability［J］. Cell Stress Chaperones，2002，7(1):55-64.

　　［9］ Minshall RD， Sessa WC， Stan RV， et al. Caveolin regulation of endothelial function［J］. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol， 2003，285(6):L1179-L1183.

　　［10］ Huang C， Zhou J， Wu S，et al. Cloning and tissue distribution of the human B3GALT7 gene， a member of the beta1，3Glycosyltransferase family［J］.Glycoconj J，2004，21(5):267-273.