双苯氟嗪对谷氨酸致海马神经元损伤的保护作用

　　　　　　作者：吴洋 张永健 苗庆峰 薛健梅 高霄飞

【摘要】 目的 观察双苯氟嗪(Dipfluzine，Dip)对谷氨酸损伤海马神经元的保护作用，并探讨其作用机制。方法 以原代培养的海马神经元作为研究对象，用谷氨酸建立海马神经元损伤模型，通过测定细胞存活率，乳酸脱氢酶(LDH)泄漏率和胞内游离钙浓度(Ca2+)变化，观察双苯氟嗪对谷氨酸致海马神经元损伤的保护作用。结果 双苯氟嗪可显著提高谷氨酸损伤海马神经元存活率，降低LDH泄漏率，对谷氨酸诱导的海马神经元细胞内Ca2+升高有明显的抑制作用。结论 双苯氟嗪对谷氨酸致海马神经元损伤具有保护作用，其机制可能与其抑制谷氨酸诱导的细胞内钙超载有关。

【关键词】 双苯氟嗪 谷氨酸 海马神经元 细胞内钙超载

研究表明，在脑缺血和脑缺血再灌注的短时间内，兴奋性氨基酸表现为大量释放状态，在脑缺血引起的神经元死亡中起重要作用［1］。双苯氟嗪(Dip)作为新型钙拮抗剂，能够选择性扩张血管、增加脑血流、改善脑微循环及脑缺血能量代谢、对亚硝酸钠和戊巴比妥钠造成的小鼠学习记忆障碍以及氯化铝(AlCl3)致阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)模型大鼠的行为及学习记忆障碍有改善作用［2］。能够改善皮质功能紊乱和脑内兴奋性与抑制性氨基酸释放失调，对脑缺血大鼠起脑保护作用［3］。本实验通过建立谷氨酸对体外原代培养的海马神经元兴奋性毒性损伤模型，拟在细胞水平观察兴奋性氨基酸对神经元的毒性作用，并观察Dip对损伤的干预作用，为开发Dip在缺血性脑血管病及其他疾病中的应用提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1．1 动物 新生SD大鼠(24 h内)，雌雄不限，河北医科大学实验动物中心提供。

　　1．2 药品和试剂 Dip (河北医科大学药学院)；乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；高糖培养基(DMEM)、多聚赖氨酸、二甲亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑盐(MTT)、Fluo-3／AM、乙二醇四乙酸酯(EGTA)、台盼蓝(美国Sigma公司)；胎牛血清(兰州民海生物制品公司)；Neurobasal A、B27 supplement、胰蛋白酶、羟乙基哌嗪乙烷磺酸(HEPES)、triton X-100(美国Gibco公司)；青霉素、链霉素(华北制药股份有限公司)；谷氨酸钠(Glu)华美生物；细胞外液(mmol／L) NaCl 145.0，KCl 3.0，HEPES 10.0，CaC123.0，葡萄糖8.0；HEPES缓冲液［4］，其他试剂均为国产分析纯。

　　1．3 仪器 VD-1320型超净工作台(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)；CO2培养箱(日本Sanyo公司)；解剖显微镜(日本Olympus公司)；XDS-1B型倒置生物显微镜(重庆光电仪器有限公司)；激光共焦显微镜(Leica公司)；FLUOstar galaxy多功能测定仪(德国BMG公司)。

　　1．4 实验方法

　　1．4．1 大鼠海马神经元培养 出生24 h内的SD大鼠，无菌条件下断头，在不含钙镁离子的Hanks液(D-Hanks液)中取海马组织，解剖显微镜下剔除脑膜及血管，剪切成约1mm×1mm×1mm的小块，0.125％胰酶37℃消化约20min。用含体积分数为10％胎牛血清的DMEM终止消化并洗涤2次，制成细胞悬液，调整细胞密度为1～2×106/mL，0.4％台盼蓝排斥试验检查，细胞存活率＞95％。将制备好的细胞悬液加入预先铺敷有多聚赖氨酸的培养板中，置37℃、5％CO2培养箱内培养。24 h后吸出培养液，换用体积分数为2％ B27的无血清培养液，每72 h半量更换含体积分数为2％B27的无血清培养液。

　　1．4．2 海马神经元谷氨酸损伤模型的建立 将培养至第7天的神经元，随机分为4组。以不含血清的DMEM液洗2遍后，损伤组加入含谷氨酸DMEM液。使其终浓度分别为0.1、0.5、1mmol/L，空白对照组加入等体积DMEM液，37℃孵育10min后，弃去上清，以HEPES缓冲液洗2遍，换NEUROBASAL-A Medium(NBM)培养。空白对照组除所加溶液不含谷氨酸外，其它处理步骤均同谷氨酸组，37℃培养24h。

　　1．4．3 Dip对原代培养海马神经元谷氨酸损伤的保护作用 细胞培养与造模方法均同前，随机分为5组。根据损伤模型结果选定损伤组谷氨酸终浓度为1mmol/L，保护组Dip终浓度分别为0.1、1.0和10μmol/L。取培养7d的海马神经元，弃去培养基上清，将1mmol/L谷氨酸溶液加入相对应各组的培养孔内，37℃孵育10min后，弃去上清，以HEPES缓冲液洗2遍，空白对照组和模型对照组换NBM培养。Dip各浓度组再加入不同浓度Dip，使终浓度为特定的浓度梯度，并置培养箱中继续培养24h。

　　1．4．4 MTT法测定细胞存活率 终止培养前4h，各孔加入MTT，使其终浓度为0.5g／L。置37℃、5％CO2培养箱内继续培养。4h后，吸去各孔上清，每孔加入DMSO，待孔内颗粒完全溶解后，于FLUOstar galaxy多功能测定仪上570 nm波长处测定各孔吸光度(A 570 nm)。海马神经元细胞存活率计算：细胞存活率％=实验组A 570 nm／空白对照组A 570nm×100％。

　　1．4．5 LDH泄漏率(LDH％)测定 收集各孔培养液上清100μL，剩余培养液中加入tritonX-100，使其终浓度为0.1％，置37℃、5％CO2培养箱继续孵育30min后，收集破膜后各孔培养液上清100μL，按试剂盒方法分别测定原上清液LDH活力和破膜后培养液LDH活力，计算LDH％(原上清液LDH活力／破膜后培养液LDH活力×100％)。

　　1．4．6 胞内游离钙荧光强度测定 损伤模型组、空白组以及Dip不同浓度保护组的分组及制备同前，将制备好的各组海马神经元移至含浓度5μmol/L Fluo-3／AM的细胞外液中，并在37℃、5％CO2培养箱中孵育45min，随后恢复正常细胞外液，采用激光共聚焦扫描方法在室温下测量钙的荧光强度。扫描时的技术参数：激发波长为488nm，发射波长525nm，每5s扫描1次，连续扫描10min，得到的荧光图像存入计算机，采用Leica confocal software自动分析扫描后荧光强度。

　　1．5 统计学方法 所有数据均以(±s)表示，采用Stata软件进行单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2．1 不同浓度谷氨酸对神经元的损伤 (表1)
　　
　　终浓度0.1、0.5及1mmol/L谷氨酸钠均可使神经元存活率下降(P＜0.01)，其中1mmol/L 谷氨酸钠组的吸光度显著低于0.1mmol/L谷氨酸钠组和0.5mmol/L 谷氨酸钠组(P＜0.01及0.05)。

　　表1 谷氨酸对原代培养海马神经元的影响（略）

　　与对照组相比**P＜0.01

　　2．2 Dip对谷氨酸致海马神经元损伤的保护作用 (表2)
　　
　　经Dip干预的受损海马神经元，LDH释放度减小(P＜0.01)；MTT法测定的吸光度增高(P＜0.05)。

　　表2 Dip对谷氨酸损伤海马神经元LDH释放、细胞活性的影响（略）

　　与谷氨酸模型组相比*P＜0.05，**P＜0.01

　　2．3 Dip对谷氨酸致海马神经元损伤后细胞内游离钙荧光强度的影响 (表3)
　　
　　谷氨酸可致体外培养的海马神经细胞钙超载(P＜0.01)，Dip可减轻由谷氨酸所致海马神经元钙超载，降低胞内钙离子浓度(P＜0.01)。

　　表3 Dip对谷氨酸致海马神经元损伤后细胞内游离钙荧光强度的影响（略）

　　与谷氨酸模型组相比*P＜0.05，**P＜0.01

　　3 讨论
　　
　　谷氨酸是人和哺乳动物脑内含量最高的兴奋性氨基酸，但其过度释放可产生严重的神经兴奋毒性，引起神经元损伤或死亡。海马是脑内对缺血、缺氧最为敏感的部位之一。与皮层神经元相比，海马神经元更易纯化且含有高密度的谷氨酸受体［5-6］。原代培养细胞比细胞株更接近生理状态的生物学特性，选用其探讨药物的作用机制就更具实际意义。因此，本研究选用原代培养大鼠海马神经元，模拟体内高浓度谷氨酸条件，研究Dip抗谷氨酸兴奋性毒性作用，以探讨Dip保护脑缺血损伤的机制。通常情况下，中枢神经元LDH渗出很少，而受损神经元LDH的渗出则明显增多。神经细胞损伤程度与LDH释放量呈正比，故测定培养液中LDH活力可作为评价神经元受损程度的指标［7］。本研究结果显示，经Dip干预的受损海马神经元，LDH释放度减小，表明细胞损伤程度降低；MTT法测定的吸光度增高，表明细胞存活率升高。结果提示Dip对谷氨酸损伤的体外培养海马神经元有一定的保护作用。
　　
　　钙在神经精神活动中具有重要生理作用，作为细胞内第二信使与神经元的功能状态、细胞代谢和信号转导密切相关。脑缺血时大量钙离子内流引起细胞内钙超载［8］，主要是脑缺血引起膜去极化和突触前兴奋性递质的大量释放，致使细胞外液中的钙离子通过电压门控通道和N-甲基-D-天门冬氨酸受体(NMDA)受体门控通道进入细胞内。另外，由于ATP供应不足和乳酸酸中毒，也促使胞内的结合钙大量释放。胞内钙超载可产生严重的毒性作用，诱发一系列病理反应，造成神经元损伤。本实验采用激光共聚焦结合Fluo-3/AM标记技术测定胞浆内游离［Ca2+］i的变化，通过荧光强度可显示胞内钙浓度［9］。本实验研究发现，给予谷氨酸后可使体外培养的海马神经细胞内钙离子浓度明显升高，且显著高于空白对照组；而给予Dip干预后钙离子浓度显著降低，说明Dip可抑制谷氨酸造成的海马神经细胞内钙超载，提示Dip可能通过降低细胞内钙，使细胞内游离钙离子不能大量增加，阻滞由于钙超载而造成的细胞损伤。

参考文献

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