【摘要】 目的 探讨敌敌畏(DDVP)纳米乳剂和乳油的施药周期对德国小蠊抗性相关酶活性的影响。方法 紫外分光光度法测定德国小蠊相关酶活性，采用轮廓分析研究纳米乳剂、乳油的施药周期与酶活性的关系。结果 施药前后DDVP纳米乳剂组、乳油组对德国小蠊酶乙酰胆碱酯酶(AchE)、1-NA和酸性磷酸酯酶(ApE)活性影响不同，平行性检验显示可以认为两杀虫剂对各酶的轮廓分析不同，F值分别为159.76、317.22和2555.50(P值均小于0.05)。结论 DDVP纳米乳剂、乳油施药后对德国小蠊AchE、1-NA和ApE活性的影响趋势不同。
【关键词】 敌敌畏 纳米乳剂 普通乳油 施药周期 德国小蠊 抗性相关酶
目前已知道敌敌畏(DDVP)纳米乳剂与乳油的施药量对德国小蠊(German Cockroaches)乙酰胆碱酯酶(AchE)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和碱性磷酸酯酶(ApE)活性的影响不同。德国小蠊酶活性改变不但与杀虫剂的种类和施药浓度有关，还与杀虫剂施药周期长短有关［1-2］。因此，有必要对敌敌畏纳米乳剂与乳油的施药周期对德国小蠊相关酶活性的影响做一对比性研究，以便了解敌敌畏纳米乳剂杀灭德国小蠊的作用机理与乳油是否相同，进一步探讨敌敌畏纳米乳剂的毒性作用。本实验旨在通过微量点滴法，观察敌敌畏纳米乳剂、乳油的施药周期对德国小蠊相关酶活性的影响，进一步探索敌敌畏纳米乳剂对德国小蠊的毒作用机理。
1 材料与方法
1.1 试剂 TritonX-100：上海化学试剂厂产品；碘化硫代乙酰胆碱、5，5′-二硫双硝基苯甲酸(DTNB)：Sigma公司产品；a-乙酸萘酯(1-NA)、1-萘酚：上海试剂一厂产品；对硝基苯磷酸二钠、固蓝B盐、考马斯亮蓝：Fluka公司产品；80%敌敌畏原油：南京电化厂产品；DDVP纳米乳剂：本试验室自行研制，乳液呈浅黄色，透明、均匀、不分层，乳油粒径约为(11.2±1.9)nm，稀释10000倍后其粒径范围为76～103nm。原液理化性质稳定，(-20±2)℃和(52±2)℃下储藏14d，室温下放置2个月均未发生浑浊，稀释液使用时现配；其它试剂均为国产分析纯或化学纯。
1.2 供试虫源及施药方法 德国小蠊由江苏省疾病预防控制中心昆虫饲养室提供。选用羽化后的健康成年雄虫，采用微量点滴法施药(死亡率为0或低于5%)。以微量点滴器将1μL(0.0001%)量点滴在试虫胸腹背板上，点滴后将试虫放入洁净果酱瓶中，正常饲养。用不施加任何药物的德国小蠊作对照，不同施药浓度的德国小蠊作为实验组。
1.3 酶活性的测定
1.3.1 酶源制备
(1)AchE酶源制备：将待匀浆的德国小蠊用流动的蒸馏水冲洗，在滤纸上吸干后，取头部，加1/15mol/L(pH8.0)含有0.5%的TritonX-100的磷酸盐缓冲液冰浴匀浆，然后再以4000r/min离心15min，取上清液作酶源。
(2)1-NA酶源的制备：待匀浆德国小蠊用流动蒸馏水冲洗，以滤纸吸干，4℃下解剖，去消化道中食物，取中肠制备酶源。于磷酸盐缓冲液(pH7.0，0.04mol/L)中冰浴匀浆，在3000r/min离心10min后，取上清液作酶源。
(3)ApE酶源制备：取中肠，pH4.6醋酸缓冲液(0.1mol/L)中冰浴匀浆，8000r/min离心15min后，取上清液做酶源。
1.3.2 酶活性的测定
(1)AchE活性的测定：按Groun改进的Ellman方法［3］，反应体系终体积0.2mL，10μL的1/15mol/L pH8.0的磷酸盐缓冲液，50μL的0.75mmol/L底物(碘化硫代乙酰胆碱)，50μL酶源(调整蛋白含量在40～80μg/mL)，30℃反应15min，加入1.8mL DTNB-磷酸盐-乙醇试剂，412nm波长下进行比色测定。
(2)1-NA酶活性测定：参照Michael和杨俭美报道的方法［4-5］，3.6mL 1-乙酸萘酯(3×104mol/L)加100μL酶液后，加0.9mL磷酸盐缓冲液(pH7.0)，30℃反应15min后，加1mL DBLS试剂(1%固蓝B盐水溶液与5%十二烷基硫酸钠水溶液，使用前以2∶5混合)，15min后在波长600nm处测定光密度，用1-萘酚制备标准曲线，定量反应产物的量。
(3)ApE活性测定：以对硝基苯磷酸二钠作为底物，配制成0.75×10-2mol/L水溶液。测定酸性磷酸酯酶活性的反应混合物为：2.3mL pH4.6醋酸缓冲液(0.1mmol/L)、0.5mL底物和200μL酶液。在37℃保温30min后，用2mL NaOH(0.1mol/L)终止反应，400nm处用热灭活后酶液作对照测定OD值，对硝基酚制备标准曲线［6］。
1.3.3 蛋白浓度的测定 按Bradford方法［7］，取0.1mL酶液，加入5mL考马斯亮蓝，595nm处测OD值，在标准曲线上查得其对应的蛋白浓度。
1.3.4 数据处理 用SAS 9.0软件进行重复测量资料的轮廓分析。
2 结果
2.1 两种DDVP乳液对德国小蠊AchE的影响对比(表1)
表1 DDVP纳米乳剂和乳油的施药周期对德国小蠊AchE活性的影响（略）
随着施药周期延长，DDVP纳米乳剂组的AchE活性随施药时间延长呈波动性抑制趋势，至施药后第18天AchE活性仍表现为降低趋势；而乳油组的AchE活性在第3天时受到最大抑制，而后酶活性开始逐渐恢复。采用SAS 9.0软件按施药类型分组作重复测量资料的轮廓分析，对处理因素主效应(施药)进行分析结果可推断：可以认为两杀虫剂施药前后德国小蠊AchE活性不同(F=193.13，P＜0.05)；平行性检验显示可以认为两组轮廓不平行，即两杀虫剂对德国小蠊AchE的影响趋势不同(F=159.76，P＜0.05)。
2.2 两种DDVP乳液对德国小蠊1-NA的影响对比(表2)
表2 不同施药周期DDVP纳米乳剂和乳油对德国小蠊1-NA酶活性的影响（略）
随着施药周期延长德国小蠊1-NA酯酶在DDVP纳米乳剂的作用下先呈波动性改变，至施药第8天以后1-NA酶活性开始抑制，直至施药后第18天酶活性仍低于对照组。乳油组的1-NA酯酶活性在杀虫剂作用下未出现抑制，施药后第8天受诱导的酶活性开始恢复，但至第18天仍然高于对照组。
采用SAS 9.0软件按施药类型分组轮廓分析，从处理因素主效应(施药)分析结果可推断：可以认为两杀虫剂施药前后德国小蠊酶1-NA酶活性不同(F=271.47，P＜0.05)；平行性检验显示可以认为两组轮廓不平行，即两种杀虫剂对德国小蠊1-NA酶的影响趋势不同(F=317.22，P＜0.05)。
2.3 两种DDVP乳液对德国小蠊ApE的影响对比(表3)
施药后第1天ApE的活性在DDVP纳米乳剂的作用下被激活，酶活性迅速升高，而后酶活性降低，直至施药后第18天酶活性逐渐抑制；DDVP乳油组的ApE施药后第1天出现降低，而后酶活性呈现强烈诱导，至第18天时酶活性仍然未恢复到原来水平。
按施药类型分组作轮廓分析，对处理因素主效应(施药)分析：可以认为两杀虫剂施药前后德国小蠊ApE活性不同(F=2242.80，P＜0.05)；平行性检验显示可以认为两组轮廓不同，即两种杀虫剂对德国小蠊ApE的影响趋势不同(F=2555.50，P＜0.05)。
表3 不同施药周期DDVP纳米乳剂和乳油对德国小蠊ApE活性的影响（略）
3 讨论
AchE是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂靶标酶，AchE的改变会导致昆虫对有机磷和氨基甲酸酯类的敏感性降低，使该酶不受抑制从而产生抗性［8-10］。以往的研究已知DDVP纳米乳剂、乳油的施药量与AchE的抑制率呈正相关，且纳米乳剂对AchE的抑制作用比乳油要高。在本次研究中，随施药时间的延长DDVP纳米乳剂对德国小蠊AchE呈波动性的抑制作用，其作用方式完全不同于普通乳油。DDVP纳米乳剂对酶活性的这种波动性抑制作用，可能与纳米乳剂将活性物质(DDVP油相)包裹在内核，导致药物缓释有关。
1-NA酶和ApE是DDVP的重要代谢酶，德国小蠊对DDVP抗药性的产生与这两种酶活性的增高密切相关［2］。本次实验中DDVP纳米乳剂组施药后1-NA酶活性呈波动性升高，特别是施药后第13天，纳米乳剂施药组的德国小蠊1-NA酶活性受到严重抑制，酶活性显著低于对照组，而乳油组的酶活性无明显降低，仍然高于对照组。ApE的活性在施药第1天迅速升高，而后却逐渐被抑制，直至施药后第18天酶活性比对照组还低，说明DDVP纳米乳剂能够有效抑制ApE活性，而乳油施药后ApE呈现强烈诱导，酶活性不断上升，虽然第13天后有所下降，但仍高于对照组。表明DDVP纳米乳剂对德国小蠊1-NA、ApE的抑制作用更强。
综上所述，DDVP纳米乳剂对德国小蠊的毒性作用与乳油完全不同，但德国小蠊对DDVP纳米乳剂的抗性产生速度是否比普通乳油要慢还需进一步证实。
参考文献
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