【摘要】 目的 研究苦参碱对卡介苗(BCG)和脂多糖(LPS)所致小鼠免疫性肝损伤动物模型的的保护作用。方法 建立BCG+LPS诱导免疫性肝损伤小鼠模型，造模第2天灌胃给苦参碱(Mat)及联苯双酯(Bif)，共10d，计算肝脏指数、脾脏指数，分光光度法检测肝组织匀浆中谷胱甘肽过氧化氢酶(GSH-Px)、总抗氧化能力(T-AOC)及丙二醛(MDA)。结果 小鼠灌胃给予苦参碱20、40、80 mg/kg，可显著降低肝脏、脾脏指数(P＜0.05，P＜0.01)；降低肝匀浆MDA含量，使降低的肝匀浆GSH-Px、T-AOC活性升高(P＜0.05)。结论 苦参碱对小鼠免疫性肝损伤有明显的保护作用，其机制可能与增强抗氧化活性有关。
【关键词】 苦参碱 免疫性肝损伤 卡介苗 脂多糖
苦参碱(matrine，Mat)是从豆科槐属植物苦豆子(Sophora alopecuroides L)中提取物的生物碱，具有抗炎、抗病毒、提高免疫力、保护肝脏功能的作用。据文献报道，Mat对CCl4致肝损伤动物模型有肝细胞保护作用［1］，但目前尚未见到苦参碱对卡介苗(BCG)+脂多糖(LPS)诱发BALB/c小鼠免疫性肝损伤保护作用的报道。本实验以BALB/c小鼠为实验对象，探讨苦参碱对BCG+LPS免疫性肝损伤的保护作用。
1 材料与方法
1.1 动物 BALB/c小鼠，雄性，6～8周龄，清洁级，由宁夏医科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(宁)2005-0001，在室温(21～23℃)、普通光照环境中饲养1周后实验，标准饲料喂养，自由饮水。
1.2 药物 Mat购自宁夏紫荆花药业有限公司，批号：80041122，白色结晶；联苯双酯购自浙江万邦药业有限公司，批号：071003，每滴丸含联苯双酯1.5mg，临用前用生理盐水配至所需浓度。
1.3 主要试剂 BCG系卫生部上海生物制品研究所产品，批号：200709001。LPS系美国Sigma公司产品，批号：LOT2010/08。MDA、GSH-Px、T-AOC试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，批号：20080306，考马斯亮蓝试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，批号：20080625。
1.4 主要仪器 AE100电子精密天平(METTLER)；UV/9100型紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)；TD5A-WS台式低速离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)；Fluko超细匀浆器(上海弗鲁克流体机械制造有限公司)。
1.5 实验方法
1.5.1 动物模型的建立、分组及处理 将BALB/c小鼠随机分组，每组7只，共6组：正常对照组、模型组、Mat给药组(20、40、80 mg/kg)、阳性对照组即联苯双酯组(bifendate，150 mg/kg)。造模方法参照文献［3-5］，除正常对照组外，其余各组第1天经小鼠腹腔注射BCG 2.5mg/0.2mL/只(约含5.0×107个活菌数)，第2天起，各给药组按0.1mL/10g体积分别给予不同剂量Mat和bifendate(联苯双酯)进行治疗，模型组和正常对照组给予同等体积NS，每天1次，灌胃给药，连续10d，第12天小鼠尾静脉注射LPS(7.5μg/0.2mL/只)进行攻击。注射LPS后，禁食12h，颈椎脱臼后颈静脉放血处死小鼠，立即摘取小鼠肝脏、脾脏标本进行有关检测。
1.5.2 指标检测 取肝脏、脾脏称重，计算脏器指数［脏器重量(g)/体重(g)×1000］。冰浴下在肝右叶相同部位取肝脏0.5g，用冷生理盐水洗去污血，加生理盐水制成10%的肝匀浆，离心10min，取上清液检测指标 MDA、GSH-Px、T-AOC(按试剂盒说明书进行)。
1.6 统计学方法 结果以(±s)表示，用SPSS 11.5统计软件进行方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Mat对免疫性肝损伤小鼠肝脏、脾脏指数的影响
与正常对照组相比较，模型组小鼠肝脏、脾脏明显肿大，Mat 20、40、80 mg/kg及阳性对照组均能降低免疫性肝损伤小鼠的肝脏、脾脏指数(P＜0.01)，见表1。
表1 Mat对免疫性肝损伤小鼠肝脏指数、脾脏指数的影响（略）
与模型组比较＃＃P＜0.01；与正常组比较△P＜0.01
2.2 Mat对免疫性肝损伤小鼠GSH-Px、T-AOC、MDA的影响
与正常对照组比较，模型组肝匀浆GSH-Px、T-AOC水平明显降低，同时MDA水平升高(P＜0.05)。Mat(20、40、80mg/kg)治疗组及Bif阳性对照组(150mg/kg)均能升高降低的GSH-Px、T-AOC水平，并降低升高的MDA水平(P＜0.05)，见表2。
表2 Mat对免疫性肝损伤小鼠肝匀浆MDA、SOD和GSH-Px水平的影响（略）
与模型组比较＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；与正常组比较△P＜0.05，△△P＜0.01
3 讨论
BCG+LPS免疫性肝损伤模型主要表现为Kuppfer细胞、单核细胞在致炎因子的作用下，向肝脏聚集并被致敏［2］。其病理机制与人肝炎的免疫功能紊乱相似，类似于人类肝炎发生的病理生理过程，是筛选和研究保肝药物较为理想的模型之一。
早期研究发现，许多慢性肝炎患者存在诸多抗体，于是人们采取了多种方法建立了免疫性肝损伤模型［6］。目前，多数学者认为，乙型肝炎病毒感染引起的肝损伤主要与机体免疫应答有关，宿主免疫调节紊乱是病理损伤的主要原因，其中细胞因子与其密切相关，并能加重肝炎病情。与化学性肝损伤模型(CCl4、D-Gal等)相比，免疫性肝损伤动物模型类似于人类肝炎发生的病理生理过程，是筛选和研究保肝药物较为理想的模型之一［7］。最新研究证明，肝损伤的发生发展与集聚在肝脏中的巨噬细胞(MΦ)的确有密切关系。BCG+LPS所致肝损伤的机制主要为巨噬细胞介导的免疫性肝损伤，BCG可使中性粒细胞和巨噬细胞聚集于肝脏，再用微量LPS进行攻击，被BCG致敏的炎症细胞会释放一些对肝细胞有毒性作用的炎症介质如肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素、活性氧、超氧阴离子、MDA、白三烯等，其中效应分子—自由基有极强的氧化能力，通过氧化反应来攻击细胞膜、线粒体膜，与膜中不饱和脂肪酸反应造成脂质过氧化，引起组织线粒体、DNA、RNA等广泛损伤，从而造成免疫性肝损伤［8］，这与临床上许多肝炎的发病机制相似［9］。活性氧能激活肝星状细胞，促进细胞外基质合成，进一步损伤肝细胞形成恶性循环，脂质过氧化产物MDA能促进肝星状细胞合成胶原。因此，氧化应激反应与肝星状细胞的激活关系密切，提示抗氧化治疗有利于减轻肝损伤。
本实验结果表明BCG+LPS诱导小鼠免疫性肝损伤动物模型组较正常组小鼠的肝、脾脏指数明显升高，GSH-Px、T-AOC活性明显降低，且MDA水平明显升高，说明免疫性肝损伤模型成立。实验中苦参碱组均能明显降低小鼠肝、脾脏指数及肝匀浆中MDA含量，提高免疫性肝损伤小鼠GSH-Px、T-AOC活性，表明苦参碱有显著的肝细胞结构和功能稳定作用，可能与苦参碱可作为自由基清除剂的诱导剂或抗氧化剂密切相关。以上研究提示，苦参碱可明显保护BCG+LPS联合诱导的免疫性肝损伤，其抗氧化作用可能是其保肝降酶作用的重要机制之一。
参考文献
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