作者：薛立华，梁颖，闫琳，宋君秋，齐永芬，贾月霞
【摘要】 ：目的 在大鼠心肌梗死致心肌纤维化模型上观察Intermedin1-53及其受体的变化。方法 通过结扎左冠状动脉前降支制备大鼠心肌梗死模型， 4周后检测心功能，梗死区心肌组织的Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达，IMD1-53和心室肌降钙素受体样受体(CL)、受体活性修饰蛋白(RAMP)1/2/3的mRNA表达。结果 与假手术组比较模型组大鼠的心功能明显减低，检测梗死区心肌组织的Ⅰ、Ⅲ胶原蛋白表达增加，心室肌IMD1-53、CL、RAMP 1/2/3的mRNA水平分别上调75%(P＜0.01)、57%(P＜0.05)、61%(P＜0.01)、48%(P＜0.05) 和80%(P＜0.05)。结论 心肌纤维化大鼠的心肌IMD1-53及其受体明显上调，其变化可能参与心肌纤维化的发病过程。
【关键词】 Intermedin1-53；心肌纤维化；降钙素受体样受体；受体活性修饰蛋白
Abstract：Objective To observe the gene expression of IMD1-53 and IMD1-53 receptors in the myocardial fibrosis rats reduced by myocardial infarction.Methods Rats with Acute myocardial infarction（AMI) were induced by left anterior descending coronary branch ligation. The cardiac function was measured .The protein levels of typeⅠand Ⅲcollagen were assayed by Western blotting and the mRNA levels of IMD1-53， CL， RAMP1， 2， 3 were determined by semi-quantitative RT-PCR in the infracted hearts after 4 weeks of operation.Results Compared with the sham-operated group， cardiac function significantly decreased， protein levels of typeⅠand Ⅲcollagen significantly increased and the mRNA levels of CL， RAMP1， RAMP2 and RAMP3 significantly elevated by 75% (P＜0.01)， 57% (P＜0.05)， 61% (P＜0.01)， 48% (P＜0.05)and 80% (P＜0.05) respectively in myocardial fibrosis rat.Conclusion The results suggest that IMD1-53 and IMD1-53 receptors system is significantly up-regulated in myocardial fibrosis and such change maybe play a part in the procession of myocardial fibrosis.
Key words：intermedin；myocardial fibrosis；calcitonin receptor-like receptor； receptor-activity-modifying protein
心肌纤维化是高血压性心室重构的主要病理特征之一，纤维化的消退能使已肥厚或不肥厚的心室组织的僵硬度正常化，并且心血管事件相关危险减少。因此，寻找有效抑制并逆转心肌纤维化的措施具有重要临床价值。Intermedin1-53（IMD1-53）是Roh等人在2004年［1］用系统进化分析法以降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）超家族成员特异的一二级结构检索基因库得到的该家族的一个新成员。初步的功能研究显示，在心血管系统IMD1-53具有CGRP超家族成员如肾上腺髓质素（adrenomedullin，ADM）相似甚至更强的舒张血管、降低血压等生物学效应。IMD1-53同家系的活性多肽ADM、CGRP在体内具有广泛的生物学效应，并因它们在心血管系统强大的抗损伤保护作用而备受关注，但IMD1-53在心肌重塑、心肌纤维化过程中起何作用及其作用途径和机制未完全清楚，本实验旨在心肌纤维化模型上，观察心肌IMD1-53、CL/RAMP1/2/3 mRNA水平的变化，旨在初步探讨IMD1-53在心肌纤维化病变时可能的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
雄性SD大鼠 (200～250g)，购于北京大学医学部实验动物中心。合成的大鼠 IMD1-53，由美国Phoenix Pharmaceutical INC提供。Trizol购自GIBCO BRL（U.S.A.）；dNTP购自Clontech co.（U.S.A.），M-MuLV逆转录酶、Taq酶、RNasin和Oligo(dT)15 Primer为 Promega co.（U.S.A.）的产品。
1.2 实验分组和动物模型的制备
35只大鼠随机分为模型组(20只)和假手术组(15只)。按照Olivetti等［2］方法稍加改良，结扎大鼠左冠状动脉前降支建立心肌梗死(myocardial infarctio，MI)模型［2］。具体方法：SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3mL/100g)麻醉动物，仰卧固定，手术部位脱毛，消毒，气管插管，接小动物呼吸机(呼吸频率90次/min)，于第4肋间逐层打开胸腔，钝性分离心包膜，暴露心脏，于肺动脉圆锥与左心耳之间，距左冠状动脉起点3～4 mm处，用6-0无创缝合线结扎左冠状动脉前降支，术中肉眼观察，结扎冠脉左前降支后，其血液供应区心脏表面颜色由红变为灰白、青紫。手术前后均记录体表心电图，以Ⅱ导ST段弓背向上抬高0.2mV以上为结扎成功的标志。假手术组只挂线而不结扎冠状动脉，其余步骤同前。术后给予青霉素4万U肌肉注射，1次/d，共3d。动物清醒后按常规饲养。术后及术后4周内模型组大鼠死亡13只，假手术组死亡8只，最终心肌梗死组7只，假手术组7只。各组均于术后4周行血流动力学和形态学检测。
1.3 导管法测量血流动力学参数
20%乌拉坦(5mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，分离右侧颈总动脉，插入与换能器连接并已充满肝素生理盐水的动脉导管至左心室，稳定5 min后，应用BL-420E型生物机能测量仪(成都泰盟科技有限公司)记录左室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)及左室内压最大变化速率(LV±dP/dt)，以反映左室功能。
1.4 左室心肌梗死区周围天狼星红染色
于左室长轴中点将左室分为两部分，心底部液氮冻存以备检测IMD1-53及其受体含量；心尖部4%多聚甲醛固定，石蜡包埋行横截面切片，片厚5μm，天狼星红染色，确定心肌纤维化程度。其余心肌组织分别进行下述测定。
1.5 RT-PCR方法测定左室心肌非梗死区IMD1-53、CL、RAMP1/2/3 mRNA表达
按我室以前的方法［3］，用Trizol一步法提取实验各组大鼠心肌总RNA，紫外分光光度计(SDU-68型)定量。取2μg RNA用M-MuLV逆转录酶及Oligo(dT)15 Primer逆转录成单链cDNA。PCR反应总体积25μL:包括cDNA 2μL，400 nmol/L的CL-S及CL-A引物各1μL，2.5mmol/LdNTP 1μL，含20mmol/L MgCl2的10×PCR缓冲液2.5ml， Taq DNA聚合酶1.25U。反应条件：95℃变性5 min，94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 40s，热循环35次。取PCR产物1μL，加200nmol/L的β-actin引物1μL，采用上述相同条件作PCR。分别取2次PCR的产物各5μL，以1.5%琼脂糖电泳分离和溴化乙锭染色后，用凝胶成像及分析扫描仪测446 bp(CL产物)和291bp(β-actin产物)四条带的光密度，以β-actin mRNA标准化。所有实验均重复3次。按上述同样方法测定IMD1-53(297 bp)、RAMP1(402 bp)、RAMP2(317 bp)和RAMP3(416bp)mRNA水平。
1.6 左室心肌非梗死区Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白Western blot检测
取心肌组织50mg加入组织裂解液［50mmol/L Tris/HCl ，pH7.4，1mmol/L EDTA］ 500μL制备匀浆。取匀浆液用Bradford法蛋白定量后行SDS-PAGE 电泳，每孔上样量100μg蛋白。转移至硝酸纤维膜(NC模)后，用含5%脱脂奶粉的TTBS（20mmol/L Tris/HCl， pH7.5， 0.05% Tween 20， 0.6% NaCl）室温下封闭1h；用兔抗大鼠Ⅰ、Ⅲ多克隆抗体(1∶250) 4 ℃孵育4h；TTBS洗脱3次后， 加二抗(辣根过氧化物酶标记的抗兔抗体， 1∶500)室温孵育1h。TTBS洗脱3次。利用化学发光法进行显色反应。结果用专业软件NIH Image分析灰度值定量。
1.7 统计学方法
结果以均数±标准差（x±s）表示， 采用One-way ANOVA 进行分析，组间比较用Student-Newman-Keuls检验，P＜0.05表明差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组大鼠血流动力学变化
（表1）表1 大鼠血流动力学变化(略)
与假手术组比较，除HR外，其他各指标两组间差异均有统计学意义（P＜0.01或0.05）；模型组大鼠±LVdp/dtmax分别降低23%和34%； LVEDP升高10.4倍。
2.2 左室心肌梗死区天狼星红染色
天狼星红染色切片显示间质胶原为红色，心肌细胞为黄色，模型组较假手术组心肌间质胶原明显增多。假手术组心肌排列规则，其间有少许胶原表达。模型组梗死区充满红色胶原，非梗死区于心肌间质周围可见明显的胶原表达（图1见封2）。
2.3 左室心肌非梗死区Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达
如图2、表2所示，与假手术组相比较，模型组大鼠心室肌的Ⅰ型胶原， Ⅲ 型胶原蛋白表达明显增加(P＜0.05或＜0.01)，分别增加106%和124%。表2 心肌梗死后大鼠左室梗死区Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达变化(略)
2.4 左室心肌非梗死区IMD1-53、CL、RAMP1、RAMP2和RAMP3的 mRNA表达与内参
β-actin mRNA比值的变化见图3、表3。表3 左室心肌非梗死区IMD1-53、 CL、RAMP1/2/3的 mRNA表达与内参β-actin mRNA比值的变化（略）
3 讨论
心肌纤维化是指在心肌的组织结构中胶原纤维过量积聚、其胶原浓度显著升高或胶原容积分数显著增加［4］。心肌纤维化可发生于高血压、心肌梗死及心力衰竭等许多心血管疾病，是多种心脏疾病发展到一定阶段的共同病理改变，是心肌重构的主要表现之一，可致心肌僵硬度增加、心室舒张功能减退、冠状动脉储备下降，甚至引起猝死。正常和疾病状态下心肌的胶原主要由心肌间质的成纤维细胞产生和分泌的Ⅰ、Ⅲ型胶原组成。血流动力学检测结果显示术后4周模型组大鼠心功能明显降低，天狼星红染色显示模型组间质红色胶原明显增多。Ⅰ、Ⅲ型胶原的检测显示，梗死4周后非梗死区Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白均有增加，说明结扎左冠状动脉前降支4周可形成心肌纤维化。
IMD1-53属于降钙素基因相关肽超家族，具有舒张血管、降低血压、增强心功能、增加冠脉血流量［5-6］等诸多心血管生理学效应。除上述生理效应外，IMD1-53对疾病状态下的心血管功能也有较强的调节作用，已知与IMD1-53同家系的ADM是体内极强的心血管细胞保护物质，对多种因素造成的心血管损伤如高血压、动脉粥样硬化、心肌缺血和心梗等均有良好的抵抗作用［7］，IMD1-53是否也是一种强大的心血管保护剂值得关注。Yang JH［8］等人在离体灌流的大鼠缺血再灌注模型上发现IMD1-47、IMD8-47和IMD1-53均明显改善缺血再灌注所造成的心功能抑制和组织损伤。贾月霞［9］等人在异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌损伤模型上也观察到IMD1-53明显改善异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌损伤。上述实验提示IMD1-53在生理及病理状态下可作为一种新的心血管调节物质发挥作用。
Fischer JA［10］ 等研究发现CRLR是CGRP、ADM和IMD1-53等CGRP家族多肽的主要受体。CRLR与RAMP1、RAMP2、RAMP3结合后形成CGRP家族多肽的功能性受体。IMD1-53与CRLR/RAMP1、CRLR/ RAMP2、CRLR/AMP3受体中的任一种均有不同程度的结合力，但目前认为，IMD1-53的功能受体可能主要是CRLR/RAMP1或CRLR/RAMP3。本研究结果显示，CRLR、RAMP1、RAMP2、RAMP3受体在模型组大鼠心肌组织的mRNA表达显著高于假手术，提示IMD1-53参与心肌纤维化作用，由此推测IMD1-53可能在心肌梗死导致的心肌纤维化病理损害中发挥保护性调控作用。由于哺乳动物心血管组织内的IMD1-53及IMD1-53受体系统最近才被发现［1］，因此心肌纤维化时心肌IMD1-53及受体变化的机制和病理意义，目前仍然不清楚，尚有待进一步的研究。
心肌纤维化心肌IMD1-53及其受体基因上调可能是心肌一种适应性保护反应，IMD1-53极有可能是一种新的内源性抗损伤物质，因此，其在心肌纤维化中的作用值得高度重视。
参考文献
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