作者：牛建国，梁雪云，文玉军，张莲香，韩怀钦，王效军，何仲义
【摘要】 目的 研究单涎酸神经节苷脂对大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤的保护作用。方法 64只SD大鼠随机分成A组(正常组，11只)、B组(假手术组，11只)、C组(NS对照组，14只)、D组(GM1治疗组，14只)、E组(GM1预防组，14只)。采用改良“线栓法”制作大鼠MCAO再灌注模型，不同方案尾静脉注射GM1。采用“盲法”分别于再灌注10min和再灌注24h对大鼠进行神经功能缺失评分；处死大鼠，A、B组3只，C、D、E组6只大鼠进行TTC染色测量脑梗死体积；各组6只大鼠用作HE染色光镜观察；各组2只大鼠用作电镜观察。结果 MCAO再灌注10min 评分结果，C、D、E组＞A、B组(P＜0.01)，C、D组＞E组(P＜0.01)；MCAO再灌注24h 评分结果，C组＞A、B、E组(P＜0.01)，D组＞A、B、E组(P＜0.05)，C组＞D组(P＜0.05)；脑梗死体积比C、D、E组＞A、B组(P＜0.01)，C组＞D、E组(P＜0.01)，D组＞E组(P＜0.05)；HE染色见梗死灶中心区神经细胞坏死，周围区细胞不同程度损伤；电镜观察A、B组细胞完整，超微结构清晰，C组细胞超微结构破坏严重，D、E组细胞超微结构破坏程度轻。结论 GM1能减小MCAO再灌注后脑梗死体积，改善神经功能障碍；GM1对大鼠MCAO再灌注损伤有保护作用。
【关键词】 单涎酸神经节苷脂；大脑中动脉；缺血再灌注；神经保护作用；大鼠
Abstract:Objective To explore the neuroprotecting effect of monosialo ganglioside (GM1) on the middle cerebral artery occlusion reperfusion in rats.Methods The SD rats were marked to group A B C D E by randomly. Group A was the normal; group B was shamoperation; group C was injected by normal saline (NS) after MCAO reperfusion; group D was injected by GM1 after MCAO and group E was injected by GM1 24 hours in advance before the operation and injected after MCAO. The rats were killed at 24h after MCAO reperfusion. Brains were removed， respectively， to be stained with TTC and calculated the infarct volume ratios. Every rat in the study was evaluated the neurobehavioral function at 10min and 24h after MCAO reperfusion. Results The neurobehavioral function at 10min of group E was the lowest among group C D E (P＜0.05)， but it was higher than those in group A and B (P＜0.01). The neurobehavioral function at 24h of group E was the lowest among group C D E (P＜0.05)， there was no difference among group A B E (P＞0.05)， Group D was lower than group C (P＜0.05). The infarct volume ratios of group C D E were higher than those in group A and B (P＜0.05). The infarct volume ratios of group D E were lower than those in group C (P＜0.05); The infarct volume ratios of group E was lower than those in group D (P＜0.05). Observing the micro structure of the neurons by TEM， the results showed tha the micro structure of the neurons were normal in group A&&B， injured heavily in group C and injured slightly in group D&&E.Conclusion The application of GM1 can provide protection for the injury induced by MCAO reperfusion. It can reduce infarct volume and decrease neurological impairment.
Key words: GM1；middle cerebral artery；occlusion and reperfusion；neuroprotection
近年来学者们在运用神经保护方法治疗急性脑梗死(acute cerebral infarction，ACI)方面进行了大量实验研究，其中神经节苷脂(Ganglioside，Gg)的作用倍受重视。目前研究所用Gg大多数是从牛脑中提取的纯化单涎酸神经节苷脂(monosialoganglioside，GM1)。研究表明外源性GM1对于周围神经损伤具有显著的保护作用，可促进神经纤维或组织的再生［1-2］。GM1对脑缺血/再灌注后的脑损伤有保护作用，可能与抗兴奋性氨基酸神经毒性、维持钙平衡、抗氧自由基反应、抑制NO合成等有关［3］。本实验是用改良方法制作的大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)再灌注模型，尾静脉注射GM1，通过神经功能缺失评分、脑梗死体积测量和电镜观察等手段，评价GM1对脑缺血再灌注损伤的保护作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
成年Sprague-Dawley(SD)大鼠64只，体重(280±10)g，清洁级，由宁夏医学院实验动物中心提供，随机分为5组。A组(正常组)11只，不进行手术，不给任何药物和试剂；B组(假手术组)11只，手术但不形成大脑中动脉阻塞，不给任何药物和试剂；C组(NS对照组)14只，行MCAO再灌注手术，MCAO 10min尾静脉注射生理盐水；D组(GM1治疗组)14只，行MCAO再灌注手术，MCAO 10min尾静脉注射GM1(TRB Pharma S.A.)3mg/kg(剂量按照人用药剂量换算成大鼠用药剂量［4］)；E组(GM1预防组)14只，行MCAO再灌注手术，分别于MCAO前24h、MCAO 10min尾静脉注射GM1 3mg/kg。
1.2 MCAO再灌注模型的制备及神经功能缺失评分
采用与前期实验相同的方法制作MCAO再灌注模型并进行神经功能缺失评分［5］，由不知情分组的实验人员分别于再灌注10min和再灌注24h对大鼠进行神经功能缺失评分。0分：无神经损伤症状；1分：提尾时右侧前肢屈曲抱于胸前；2分：向右侧转圈；3分：向右侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失；5分：死亡。
1.3 TTC染色及脑梗死体积比测量
A、B组各3只，C、D、E组各6只大鼠进行脑组织TTC染色测量脑梗死体积比。MCAO再灌注24h，水合氯醛麻醉大鼠，开颅取脑，采用与前期实验同样的方法［5］进行TTC染色并计算脑梗死体积的百分比。
1.4 HE染色
每组6只大鼠进行脑组织HE染色。MCAO再灌注后24h，水合氯醛麻醉大鼠，先后用37℃生理盐水及4%多聚甲醛溶液经心脏灌注固定脑组织。开颅取脑，4℃ 4%多聚甲醛溶液中固定24h，移入30%蔗糖液中，至沉底后切片。鼠脑在恒冷切片机上距前极2mm处起开始切片，每隔100μm 连续切片10张，片厚20μm，贴裱于蘸胶载玻片上进行苏木精-伊红染色。光镜观察染色结果，确定梗死灶的存在，比较各组标本缺血中心区、周围区神经细胞的损伤程度。
1.5 电镜标本制作
每组2只大鼠用于脑组织电镜标本制作。MCAO再灌注后24h，水合氯醛麻醉大鼠，先后用37℃生理盐水及二甲砷酸-戊二醛溶液经心脏灌注固定脑组织。开颅取脑，参照孙明［6］等半暗带定位方法，于前囟左侧3mm处切取1mm×1mm×1mm脑皮质块，立即置入2%戊二醛溶液4℃固定2h。组织块经二甲砷酸缓冲液漂洗3次(每次2h)后，用1%锇酸4℃后固定2h。组织块按程序进行脱水、浸透、包埋后，用LKB-V超薄切片机进行超薄切片，柠檬酸铅溶液染色并在透射电镜下观察。各标本在不同视野、放大倍数下进行观察并摄片，用MICROTEK3600扫描仪扫描负片，图像输入计算机。
1.6 统计学方法
各组数据均以均值±标准差(±s)表示，组间比较采用方差分析，由SPSS 11.5软件处理。
2 结果
2.1 大鼠神经功能缺失评分
MCAO再灌注10min 评分结果，C、D、E组明显高于A、B组(P＜0.01)，E组低于C、D组(P＜0.05或0.01)。
MCAO再灌注24h评分，与再灌注10min 评分相比，C、D、E组评分均降低；C组评分仍高于其他各组(P＜0.01或0.05)；D组低于C组(P＜0.05)但高于E组(P＜0.05)，见表1。表1 GM1对大鼠MCAO再灌注神经功能缺失评分的影响（略）
2.2 大鼠脑梗死体积比
A组和B组的梗死体积比为0，C、D和E组脑梗死体积比高于A、B组(P＜0.01)；C组大于D组和E组(P＜0.01)，D组大于E组(P＜0.05)，见表2。表2 GM1对大鼠MCAO再灌注模型脑梗死体积的影响（略）
2.3 大鼠脑组织HE染色观察结果
光镜下，除A组和B组外，其余各组大鼠脑组织均见明显的梗死灶，位于纹状体外侧部和部分额、顶、颞叶皮质。梗死灶中心区几乎所有神经细胞坏死，血管和白质破坏，组织结构消失，呈粉红色的均质，可见炎细胞的浸润。由中心向外到正常脑组织之间有一环形区域，细胞损伤逐渐减轻，正常神经细胞逐渐增多(图1，见封2)。
2.4 大鼠脑组织梗死灶周围区电镜观察结果
A组和B组大鼠脑组织神经细胞核大而圆，核膜光滑完整，染色质密度均一，核仁明显；细胞质中线粒体丰富，双层膜结构完整、清晰，嵴完整，基质均一；高尔基体、粗面内质网发达，可见整齐排列的粗面内质网；突触多见，结构完整清晰。C组多见凋亡细胞，核皱缩，核膜完整，染色质边集；细胞质中出现空泡；线粒体肿胀，嵴消失，呈空泡；其它细胞器损伤严重，结构不清楚；突触结构破坏，数量少。D组和E组凋亡细胞少见，细胞损伤程度轻，核大，核膜完整，染色质密度均一；细胞质中线粒体丰富，外膜完整、清晰，部分嵴断裂，基质均一；高尔基体、粗面内质网发达；结构正常的突触多见(见图2)。
3 讨论
3.1 MCAO再灌注后脑损伤的病理变化
局灶性脑缺血病灶由缺血“中心区”(ischemic core)和周围的“半暗带”(ischemic penumbra)组成，缺血中心区由于血供迅速、完全中断，病变的方式是细胞的不可逆坏死；半暗带为位于最严重缺血区和正常灌注区之间的中间区，其血流已减少到神经元的功能及相应电活动中断，但尚能维持细胞膜泵和离子梯度的水平，功能的丧失在一定时限内具有可逆性［7-8］。在有利条件下，半暗带神经细胞可向正常方向发展，恢复功能；而在不利情况下会转化为不可逆的死亡，并从中心向邻近组织扩散，致坏死区扩大［9］。
本实验HE染色可观察到，位于纹状体外侧部和部分额、顶叶皮质的梗死灶，其中心区内几乎所有细胞坏死，血管和白质破坏，组织结构丧失，对苏木精的亲和性降低，呈现粉红色的均质，可见炎细胞的浸润。在病灶中心坏死区和正常脑组织之间存在过渡区域，界限不清，细胞的形态和密度逐渐变化，且不同组别表现不尽相同，推测此区即为“半暗带”。
3.2 GM1可减小MCAO再灌注损伤脑梗死体积，改善MCAO再灌注损伤神经功能障碍
脑梗死体积是反映病灶中心坏死区大小的直接指标，TTC染色是一种用于评价组织内脱氢酶活性的大体标本染色方法，TTC能与正常线粒体氧化酶系统发生反应而降解成深红色的formazan［10］，受损线粒体缺乏降解TTC的酶而呈现白色使得受损组织与正常组织极易区分开来。所以TTC染色被广泛用于标记脑组织缺血性损伤，计算脑梗死灶体积［11］。本实验中D组和E组体积比均小于C组，说明给MCAO再灌注模型大鼠注射GM1能明显减小脑组织梗死的体积，减轻脑损伤程度。神经功能缺失评分是反映脑梗死损伤程度和治疗效果的终末指标。通过前期实验亦证明本实验采用的评分标准能比较准确反映脑梗死的程度和脑功能恢复情况［5］。本实验结果显示，E组MCAO再灌注10min评分和再灌注24h评分都明显优于C组；D组MCAO再灌注24h评分也优于C组，说明GM1可明显改善脑梗死后大鼠的神经功能障碍。外源性的GM1注射到动物体内后，容易通过血-脑屏障，约8～16h在脑组织中达到高峰，并且在受损区域局部浓度最高［12］。本实验中MCAO再灌注10min评分，D组与C组没有差异，而E组的评分优于C组和D组，可能由于此次评分距D组注射GM1时间太短，D组大鼠脑组织中GM1浓度尚低有关。E组因术前24h给药，而GM1的半衰期较长，脑组织中持续高浓度的GM1在脑组织损伤初期便发挥神经保护作用，减轻了缺血期的损伤，也减轻了再灌注的损伤，更大程度地阻止了半暗带向坏死区发展。E组脑梗死体积比小于D组，也提示预防用药对于急性脑梗死有更好的保护作用。
3.3 GM1改善梗死灶周围区域神经细胞的超微结构
细胞超微结构是反映细胞损伤程度最直观的指标。本实验中在梗死灶周围区（“半暗带”）取材进行电镜观察，发现C组梗死灶周围区大多细胞呈现凋亡特点，出现细胞坏死，突触结构破坏、数量减少；D组和E组细胞大部分结构正常，部分细胞有凋亡迹象，但数量少且程度轻，坏死细胞比例明显减少，突触结构正常。这些细胞超微结构的差异说明GM1明显起到了保护梗死灶周围区神经细胞超微结构的作用，可减缓细胞坏死而引起梗死灶扩大，促进突触结构与功能的恢复，进而改善神经功能。
有学者认为线粒体的能量储备在细胞死亡中起着决定性的作用：细胞是死亡还是存活，ATP起到“刻度尺”的作用，而线粒体则起到“转换器”的作用［13］，如果损伤程度相对轻微，线粒体合成ATP的能力得以保留以提供细胞凋亡或存活所需的能量，则发生凋亡或存活；若损伤严重，线粒体合成的ATP急剧耗竭，则细胞坏死。本实验对神经细胞内线粒体的观察发现，D组和E组线粒体结构明显好于C组，说明GM1对线粒体有很好的保护作用，这可能也是GM1发挥神经保护作用的重要途径。研究表明线粒体在调控细胞凋亡中起重要作用［14］，可以推测GM1的神经保护作用可能与参与“半暗带”细胞的凋亡的调控有关。
参考文献
［1］何仲义，张崇智，焦旭文，等.GM-1对异种神经移植后再生和修复的研究［J］.天津医药， 2002， 9(30): 541-543.
［2］Zalish M， Lavie V， Duvdevani R， et al. Gangliosides attenuate axonal loss after optic nerve injury［J］. Retina， 1993，13 (2):145-147.
［3］Phillis JW， O'Regan MH. GM1 ganglioside inhibits ischemic release of amino acid neurotransmitters from rat cortex［J］. Neuroreport， 1995， 6(15):2010-2012.
［4］施新猷.医用实验动物学［M］.西安: 陕西科学技术出版社，1989: 525.
［5］牛建国，文玉军，张莲香，等.大鼠大脑中动脉阻塞再灌注模型改良的实验研究［J］.宁夏医学院学报，2008，30（1）：7-11.
［6］孙明，赵育梅，徐超.局灶性脑缺血再灌注损伤核心区及半暗带组织学定位［J］.中华神经外科学杂志，2003，19(4):259-262.
［7］Abtrup J， Symon L， Siesjo BK， et al. Thresholds in cerebral ischemia:the ischemic penumbra［J］. Stroke， 1981， 12: 723.
［8］Memezama H， Smith ML， Siosjo BK，et al. Penumbral tissue salvaged by reperfusion following middle cerebral artery occlusion in rats［J］. Stroke， 1992，23(3):552-559.
［9］Baron JC. Mapping the ischemic peumbra with PET: implications for acute stroke treatment［J］. Cerebrovasc Dis， 1999， 9(4):193-201.
［10］Naddas MM， Sandriter TK. Microscopic identification of early myocardial infarcts by dehydrogenase alterations［J］. Am J Pathol， 1963， 42: 379-405.
［11］Goldlust EJ， Paczynski RP， He YY， et al. Automated measurement of infarct size with scanned images of triphenylte trazolium chloride-stained rat brains［J］. Stroke， 1996， 27(9):1657-1662
［12］胡志兵，陆雪芬.神经节苷脂GM1在缺血缺氧性脑损伤防治中的研究进展［J］. 广州医学院学报， 1999，27(1):79-82.
［13］Richter C， Schweizer M， Cosarizza A， et al. Control of apoptosis by the cellular ATP level［J］. FEBS Letters， 1996， 378(1):107.
［14］Gorman A， Ceccatelli S， Orrenius S， et al. Role of mitochondria in neuronal apoptosis［J］. Dev Neurosci， 2000，22(5-6):348-359.