嗜肺军团菌ip基因的克隆及其原核表达

【摘要】 　　目的 克隆嗜肺军团菌主要免疫原蛋白ip 基因， 构建重组质粒pET-ip，并在原核系统中表达。方法 采用聚合酶链反应(PCR)， 从嗜肺军团菌基因组DNA 中扩增军团菌主要免疫原蛋白ip 基因 ，并将其定向克隆至原核表达载体pET-32a(+)，构建原核表达重组质粒pET- ip，经限制性内切酶鉴定、PCR及测序分析后，转化宿主菌大肠杆菌BL21， IPTG诱导表达，产物进行SDS-PAGE 电泳、免疫印迹分析鉴定。结果 扩增出了792 bp 完整的ip 基因，构建的原核表达重组质粒pET- ip 表达出49 kDa Trx-IP的融合蛋白质，Westernblot 证实获得蛋白为所需要的目的蛋白。结论 成功构建了军团菌ip 基因的原核表达载体， 并在大肠杆菌中得到了高效表达。

【关键词】 军团菌;ip基因;克隆;基因表达

　　Abstract: Objective To clone the ip gene of Legionella pneumophila， to construct recombinant plasmid and to detect its expression in prokaryotic cell. Methods The ip gene was amplified from the genomic DNA of Legionella pneumophila with PCR， and then was inserted into the prokaryotic expression vector pET32a(+).The prokaryotic expression recombinant plasmid pETip was constructed.After identification with restriction enzyme analysis， PCR and nucleotide sequencing analysis， the E. coli BL21 containing the recombinant plasmid pETip was induced with IPTG. The expression of ip was subsequently detected by SDSpolyacrylamine gel electrophoresis and Westernblot analysis. Results The ip gene of 792 bp long was amplified and the recombinant plasmid pETip was constructed. SDSPAGE analysis showed that the Trx IP fusion protein of approximately 49 kDa in size was expressed. The expressed proteins could be confirmed by western blot. Conclusion The prokaryotic expression recombinant plasmid pETip was constructed successfully and its expressed efficiently in E. coli.

　　Key words：legionella pneumophila；ip gene；clone； gene expression

　　嗜肺军团菌是引起军团病的主要病原体，通过空气传播，进入呼吸道的病原体在肺泡上皮细胞和单核巨噬细胞内增殖而发病。随着人们生活水平的提高，其危害性日益受到关注，目前尚无理想的防治措施，研制有效的军团菌疫苗是十分必要。嗜肺军团菌主要免疫原基因ip编码产生的29kDa外膜蛋白（29 kDa immunogenic protein，IP）［1］，为嗜肺军团菌1～10血清型所共有，具有种特异性，是机体免疫应答反应的主要免疫原。生物信息学分析显示其含有丰富的B细胞、T细胞表位，具有高度保守性，故选ip 基因为构建DNA疫苗抗原候选基因。本研究通过PCR扩增获得嗜肺军团菌ip基因，将其定向克隆入原核克隆载体pET-32a(+)，构建重组质粒pET-ip，经鉴定后，并使ip基因在原核系统中得到表达，为进一步研究IP蛋白的结构、功能及其免疫原性和保护性功能等奠定基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　嗜肺军团菌L1标准株及相应兔血清抗体由中国疾病预防控制中心传染病控制所惠赠。克隆宿主大肠杆菌DH5a，质粒pET-32a(+)均由本室保存；限制性内切酶 Hind Ⅲ 和BamHⅠ 购自TOYOBO，NEB T4DNA连接酶购自基因生物技术有限公司，辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(H+L)及浓缩型DAB试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 嗜肺军团菌ip基因的PCR扩增

　　接种嗜肺军团菌L1于BCYE-a琼脂培养基，37℃烛缸法培养5 d左右，收获细菌，提取其基因组DNA［2］。根据文献报道的ip基因序列［1］，自行设计合成扩增军团菌ip基因的引物，分别在5' 端加上限制性核酸内切酶Hind Ⅲ 和BamHⅠ，引物序列如下：ip的上游引物(P1):5′-GGAAGATCTAAGCTT ATGGGAGGTTCAATGAG -3′，ip下游引物(P2): 5′-TTAATAAGC GGATCC TTACCAGGCTGGTATTG- 3′。

　　配制50 μL PCR扩增体系：Ex Taq premix 25 μL， Primer P1（50 pmol/L）1 μL，Primer P2（50 pmol/L）1 μL，基因组DNA 1 μL，灭菌蒸馏水22 μL。PCR扩增设阴性对照，1 μL灭菌蒸馏水代替模板DNA建立扩增体系。扩增条件：94℃预变性5 min；94℃变性 30 s，52℃ 退火45 s，72℃ 延伸60 s，30个循环；最后72℃延伸5 min。反应结束后取3 μL扩增产物，用1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测。

　　1.2.2 原核表达重组质粒pET-ip构建及鉴定

　　分别将限制性核酸内切酶Hind Ⅲ 和BamHⅠ 消化PCR扩增的ip基因和载体pET-32a(+)适当比例混合，T4 DNA连接酶16℃连接过夜，转化200 μL 感受态DH5a，37℃过夜培养，随机挑取单个菌落接种于5 mL含氨苄青霉素（60 mg/L）的LB培养液，增菌后以碱裂解法小量提取质粒，随后对所提质粒采用引物P1、P2进行PCR扩增及用限制性内切酶Hind Ⅲ 和BamHⅠ 进行单、双酶切鉴定。

　　1.2.3 基因序列测定

　　取酶切及PCR鉴定阳性重组质粒的细菌，菌液送上海英骏生物技术有限公司，用通用引物对重组质粒pET-ip进行反向测序，对其进一步鉴定。

　　1.2.4 pilE基因的诱导表达

　　将pET-32a(+)和pET-ip质粒转化到BL21细菌中，接种于5 mL含氨苄青霉素（60 mg/L）的LB培养液，培养至对数期(A550=0.6)，经终浓度为1.0 mM的IPTG诱导，收集诱导0、1、2、4、6h的培养物，制备蛋白样品，经10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶进行固定、考马斯亮蓝染色、脱色，拍照保存结果。

　　1.2.5 Western blot分析

　　取适量诱导不同时间的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离，浸渍转印法将蛋白条带转移至硝酸纤维素膜上，将膜4℃过夜封闭，洗膜，与1∶1000稀释的兔血清（一抗）4℃过夜，再次洗膜，与1∶5000稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体(二抗)37℃ 孵育1 h，DAB显色试剂盒显色，拍照保存结果。

　　2 结果

　　2.1 嗜肺军团菌ip基因的PCR扩增

　　用引物P1、P2对嗜肺军团菌L1基因组DNA进行PCR扩增，1.0% 琼脂糖凝胶电泳分析，结果扩得一条约790 bp预期大小的产物条带；阴性对照无产物条带（图1）。

　　2.2 pET-ip的PCR及限制性酶切鉴定结果

　　用引物P1、P2对所构建的重组质粒pET-ip进行PCR扩增，得到一条约790bp的预期条带；用限制性内切酶Hind Ⅲ对所获得重组质粒pET-ip 进行单酶切分析，电泳结果显示有对应约6690bp的条带出现；用Hind Ⅲ和BamHⅠ双酶切分析，同一泳道可见约5900bp和约790bp的两个条带出现，分别与pET-32a(+)空质粒和ip基因大小一致（图2）。

　　2.3 ip基因序列测定结果

　　测序结果提交GenBank进行Blast比对分析。pET-ip测序结果显示与嗜肺军团菌L1的ip 基因具有98%的同源性，12个碱基位点发生突变(第48位C-T，第52位G-A，第138位A-G，第228位C-T，第231位T-G，第273位A-T，第357位A-T，第382位A-C，第405位A-T，第552位A-G，第612位T-C，第678位C-A)，2个氨基酸位点发生改变(第18位V-I，第128位I-L)，两个氨基酸都是同类氨基酸的相互替代，对蛋白质的空间结构和功能没有大的影响，基本上未影响抗原决定基。利用NCBI的ORF finder 查找ip 基因阅读框架，含完整ORF(open reading frame)，起始密码和终止密码，ip基因片段长为792bp，共编码263个氨基酸，推测相对分子质量约为29 kDa。

　　2.4 表达蛋白的SDS-PAGE检测

　　在SDS-PAGE凝胶电泳图上，经IPTG诱导，pET-ip的宿主菌蛋白样品在约49 kDa(标签Trx.Tag蛋白与IP蛋白形成的融合蛋白)处明显出现一条较浓重的条带；pET-32a(+)的宿主菌蛋白样品在约20 kDa处明显出现一条较浓重的Trx.Tag条带，而未诱导样品均未见相应特异条带(图3)。

　　2.5 Western-blot鉴定结果

　　含有重组质粒pET-ip的BL21经IPTG诱导表达的产物在约49 kDa处出现一条特异性条带；而含有pET-32a(+)的BL21诱导表达产物未检测到特异性杂交信号(图4)。

　　3 讨论

　　29 kDa蛋白是嗜肺军团菌的主要外膜蛋白，也是嗜肺军团菌含量最多的蛋白［3］。蛋白免疫印迹检查结果表明，嗜肺军团菌1～10血清型感染患者的血清，均与29 kDa蛋白抗原反应，呈阳性反应的血清用大肠埃希氏菌细胞吸收后，并不能消除29 kDa蛋白反应；用嗜肺军团菌1型菌细胞吸收后的阳性血清能消除29 kDa蛋白反应［4］。用直接免疫荧光法检测结果显示，嗜肺军团菌1型29 kDa蛋白的单克隆抗体能与嗜肺军团菌1-10型发生反应，其阳性率为100%，与米克戴德军团菌、约旦军团菌、瓦茨沃斯军团菌、伯明翰军团菌、长滩军团菌均不发生反应，与肺炎链球菌、流感嗜血杆菌也不发生反应。1-10型LP均有29kDa外膜蛋白的存在，具有种的特异性［4-5］。
　　
　　29 kDa蛋白也是嗜肺军团菌致病因素之一，具有与宿主细胞黏附作用［1］。嗜肺军团菌29kDa外膜蛋白也可与补体系统中的成分C3b和C3bi结合，介导调理素吞噬作用，从而使军团菌更易侵入宿主细胞。嗜肺军团菌的外膜蛋白可阻止吞噬细胞的吞噬体与溶酶体融合，使细菌在吞噬细胞内生长、繁殖［6］。29 kDa蛋白在军团菌的致病性与宿主的相互作用、免疫保护等方面有关，其确切的生物学功能目前还不清楚，须进行相关的体内外实验来证实。

　　在构建原核表达载体时，选用了pET-32a(+)融合表达载体，主要由于pET是E.coli中克隆表达重组蛋白功能最强大的系统。在pET表达系统，目标基因克隆入质粒后，处于T7强转录翻译信号的调控之下，宿主细胞中的T7RNA聚合酶具有诱导表达的作用，该酶具有高选择性及活跃性，细胞在充分诱导的条件下，细胞内所有的资源将被调动起来转向目标基因的表达；诱导表达后仅几小时，目的蛋白就可占到细胞总蛋白的50%以上。该系统的另一个突出特点是在未诱导时使目的基因完全处于沉默状态而不转录［7-8］。

　　pET-32a(+)是一个高效表达载体，在目的片段前融合有硫氧还蛋白(Trx)，可使外源蛋白与109个氨基酸残基的硫氧还蛋白融合在一起而增加外源蛋白的可溶性，也可帮助目的蛋白折叠，有助于可溶性蛋白含量的提高，同时在其N端有6个 His融合表达的克隆位点，便于目的蛋白的亲和纯化［9］。

　　用于克隆的宿主菌通常是JM109和DH5a。这些菌株转化率很高，且质粒产量高，适合于保存带有克隆目的基因的pET载体，所以我们选择了DH5a为克隆宿主菌，而用于表达的宿主菌选用了BL21(DE3)。由于重组质粒只有转化到带有染色体T7RNA聚合酶基因的大肠杆菌中，才能开始生产蛋白。这些菌株都是噬菌体DE3的溶原菌，噬菌体DE3是λ的一种衍生噬菌体，带有噬菌体2I 抗性区和lac I 基因，lac UV5启动子，以及T7RNA聚合酶基因。这一区段被插入int 基因，阻止了DE3在没有辅助噬菌体时整合染色体上或从染色体切出。一旦形成DE3溶原状态，就只有受IPTG诱导的lac UV5启动子指导T7RNA聚合酶基因转录，质粒上的目的DNA开始转录［10］。

　　本研究采用聚合酶链反应(PCR)从嗜肺军团菌DNA中扩增得到29 kDa外膜蛋白ip基因，插入原核核表达质粒pET-32a(+)，经限制性核酸内切酶鉴定、PCR和核酸序列分析，表明成功构建重组质粒pETip。含有重组质粒pETip的BL21细菌通过IPTG诱导，SDS-PAGE蛋白电泳，Western blot分析发现重组细菌在相对分子质量49 kDa处出现一条特异条带，正好是标签蛋白Trx.Tag 相对分子质量(20 kDa)与IP的相对分子质量(29 kDa)的总和，与预期融合蛋白相对分子质量相符，表明成功构建了Trx-IP融合蛋白重组原核表达系统，为进一步从分子水平探讨嗜肺军团菌29 kDa外膜蛋白的结构功能、核酸疫苗及其免疫原性和免疫保护性以及临床诊断试剂研制提供了研究基础。

参考文献

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