MMP-9与TIMP-1在原发性干燥综合征患者唇腺组织中的表达

　　　　作者：竺红，朱彩侠，王莉，宫怡，李国富，朱蓉，王海英， 李海波

【摘要】 　　目的 探讨基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、组织抑制剂-1(TIMP-1)在原发性干燥综合征(PSS)发病过程中的作用。方法 采用免疫组化检测PSS患者唇腺中MMP-9、TIMP-1表达。结果 PSS患者唇腺组织中MMP-9高表达，TIMP-1低表达，而健康对照组唇腺组织中MMP-9低表达，TIMP-1高表达；MMP-9的表达强度随唇腺病理分级升高而增强，TIMP-1 的表达随唇腺病理分级升高而减弱；MMP-9与TIMP-1的表达呈现负相关性。结论 MMP-9、TIMP-1可能参与了PSS的发病过程。

【关键词】 干燥综合征；原发性；基质金属蛋白酶-9；组织抑制剂-1；唇腺

　　Abstract：Objective To study the relationship between MMP-9，TIMP-1 and their roles in the pathogenesis of Primary Sjgrens’s Syndrome.Methods Immunohistochemical technique was employed to detect the expression of MMP-9 and TIMP-1 in the labial gland acini.Results The expression of MMP-9 in the labial gland acini in the primary Sjgrens’s Syndrome patients was increased significantly(P＜0.01)，the expression of TIMP-1 in the labial gland acini in the primary Sjgrens’s Syndrome patients was decreased significantly(P＜0.01)，The expressioned degrees of MMP-9 was correlated negatively with the the expressioned degree of TIMP-1，and the Pearson's correlation coefficient was-0.534(P＜0.01).Conclusion MMP-9，TIMP-1 might be involved in the pathogenesis of Primary Sjgrens’s Syndrome.

　　Key words：Sjgrens’s Syndrome；primary；matrixmetalloproteinase-9；tissue inhibitor of metalloproteinase 1；salivary glands

　　原发性干燥综合征(Primary Sjgrens’s Syndrome，PSS)是一种病因不明，主要累及外分泌腺的自身免疫性疾病，以眼干、口干为主要表现［1］。基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)是蛋白酶家族中的重要成员之一，能降解细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，在许多生理和病理过程中发挥重要作用，包括免疫和炎症反应。而组织抑制剂-1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP-1)是MMP-9的特异性抑制剂。MMPs在肿瘤的发病作用已有较多报道［2-3］。本研究应用免疫组化SP法对PSS患者唇腺组织中MMP-9及其抑制剂TIMP-1进行检测和分析，从而探讨二者在PSS发病机理中的作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料来源

　　PSS患者59例，均为2004年3月-2006 年10月宁夏医学院附属医院风湿科门诊及住院的干燥综合征患者，所有病例均符合2002年干燥综合征国际诊断标准［4］，男3例，女56例，年龄25～65岁，平均(45.46±11.86)岁；病程1个月～10年，平均(2.27±2.91)年。健康对照组30例，男3例，女27例，男∶女＝1∶9，年龄23～51岁，平均(42.21±10.11)岁，均为健康志愿者。均于受检者下唇内侧黏膜部常规取材，石蜡包埋作为对照组。两组患者年龄、性别等差异无统计学意义。测定前先将石蜡包埋组织块作常规组织切片在光镜下核对诊断，证实其病理诊断无误方可采用。

　　1.2 检测方法

　　石蜡包埋的唇腺组织修材后连续切片厚4μm，4张，分别做HE染色及免疫组化染色-采用链霉菌抗生物素-蛋白过氧化酶法(SP法)。常规处理后，微波炉抗原修复，依次加入即用型一抗(鼠抗人MMP-9，兔抗人TIMP-1工作液)、生物素标记二抗，DAB显色、苏木素复染。具体操作步骤严格按试剂盒说明进行。用已知阳性片作阳性对照，PBS代替一抗作空白对照。鼠抗人MMP-9、兔抗人TIMP-1工作液和即用型SP免疫组化染色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

　　1.3 结果判断标准

　　MMP-9和TIMP-1以胞质内出现黄色颗粒状物质为阳性，按着色强弱分级计分：无着色为0，浅黄色为1，深黄色为2，棕黄色为3；着色范围以在40倍镜下随机选取5个视野(每个视野计数100个细胞)计数阳性细胞所占的百分比均值：＜25%为1，25%～50%为2，＞50%为3。上述两项相加即为MMP-9或TIMP-1的强度积分：＜2为阴性，＜3为弱阳性(+)，3～4为阳性(2+)，＞4为强阳性(3+)。

　　1.4 统计学方法

　　两样本计数资料比较采用非参数秩和检验(校正的χ2检验)、Pearson相关性分析。

　　2 结果

　　2.1 MMP-9、TIMP-1在各组唇腺组织免疫组织化学染色表达

　　2.1.1 MMP-9在各组唇腺组织表达

　　健康对照组：表达于唇腺组织导管上皮细胞、腺泡上皮细胞(图1，见封3)。PSS组：表达于PSS患者唇腺组织导管上皮细胞、腺泡上皮细胞、淋巴细胞浸润灶(图2，见封3)，与正常对照组的表达比较，差异均有统计学意义(P＜0.01)，见表1。

　　2.1.2 TIMP-1在各组唇腺组织表达

　　健康对照组：于唇腺组织导管上皮细胞、腺泡上皮细胞呈高表达(图3，见封3)。PSS组：于PSS患者唇腺组织导管上皮细胞、腺泡上皮细胞、淋巴细胞浸润灶呈低表达(图4，见封3)，与正常对照组的表达比较，差异均有统计学意义(P＜0.01)，见表1。表1 MMP-9、TIMP-1在两组唇腺中表达比较（略）

　　2.2 MMP-9与TIMP-1在PSS患者唇腺组织阳性表达的相关性

　　PSS组MMP-9的表达强度随着PSS唇腺病理分级升高而增强，TIMP-1的表达随着PSS唇腺病理分级升高而减弱。MMP-9与TIMP-1在PSS患者唇腺组织的表达强度呈负相关(r=-0.534，P＜0.01)，见表2。表2 MMP-9、TIMP-1在PSS患者唇腺中表达强度与病理分级的关系（略）

　　3 讨论

　　细胞外基质在维持正常组织结构与功能、细胞的生长和分化过程中起重要作用，其降解主要依靠蛋白水解酶类。MMPs是四类蛋白水解酶中较为重要一类。MMPs是依赖锌离子的内肽酶，可降解几乎所有的细胞外基质，包括各种胶原、蛋白多糖和基质蛋白。MMP-9为基质金属蛋白酶家族成员之一，其主要功能是分解细胞外基质CME的层黏连蛋白，参与人体许多生理和病理过程。TIMP-1是MMP-9的特异性抑制剂，生理情况下与MMP-1的活性部分以1∶1结合，使细胞外基质破坏及修复维持动态平衡，一旦这种平衡失调将引发一系列病理生理改变。PSS是自身免疫性疾病，其显著性的特征是涎腺组织中大量的淋巴细胞浸润成灶，造成腺体的结构破坏和功能受损。Perez等［5］研究报道PSS患者唇腺组织局部MMP-9的高表达，但淋巴细胞浸润区未见表达。

　　本研究亦发现MMP-9在PSS组患者唇腺组织中高表达(P＜0.01)，并且表达强度随着病理分级的升高而表达增强(P＜0.01)，并且淋巴细胞浸润灶亦有表达，提示PSS唇腺组织局部的MMP-9合成增加是伴随着淋巴细胞的移行及浸润增加，局部炎症的严重程度越重，MMP-9的分泌越多，参与腺体组织破坏的作用越强，说明MMP-9在PSS患者唇腺组织病变的全过程发挥作用。TIMP-1在PSS患者唇腺组织中呈现低表达(P＜0.01)，并且表达强度随着病理分级的升高而表达减弱(P＜0.01)，表明TIMP-1的生成是随着淋巴细胞浸润程度增长而进一步受到抑制，提示PSS患者唇腺组织中大量聚集的淋巴细胞产生多种细胞因子，可以影响TIMP-1生物活性，使其生成及活性减少，同时，本研究显示MMP-9与TIMP-1的表达间存在负相关性(r=-0.534，P＜0.01)，表明TIMP-1对MMP-9的抑制作用下降，而导致唇腺组织中MMP-9的产生增加。MMP-9降解其基底膜中的层黏连蛋白作用加强，而基底膜介助层黏连蛋白与上皮细胞紧密连接［6］，一旦基底膜结构不完整，二者连接受到影响，导致腺体功能受损。Masumi［7］等报道PSS患者唾液中MMP-9水平明显升高，而TIMP-1水平升高不明显，推测PSS患者涎腺功能的损伤有MMP-9与TIMP-1的参与，本研究结果有相似之处。

　　有关MMPs抑制剂对肿瘤和部分自身免疫性疾病治疗作用的研究已有报道［8-9］，深入探讨PSS患者唇腺组织MMP-9的表达及其与TIMP-1表达间的关系，有可能为PSS提供新的治疗靶点。

参考文献

　　［1］张乃峥.临床风湿病学［M］.上海：上海科学技术出版社，1999：290.

　　［2］Okada A.Role of matrix matelloproteinases and tissue inhibitor of metelloproteinases(TIMP)in cancer invasion and metastasis［J］.Can To Kgaku Ryoho，1999，26(14)：2247.

　　［3］Mukhopadhyay S，Munshi HG，Kambhampati S，et al. Calciuminduced matrix metall-oproteinase9 gene expressionis differentially regulated by ERK1/2 and p38 MAPK in oral keratinocyte sand oral squamous cell carcinoma［J］.J Biol Chem，2004，79(32)：33139-33146.

　　［4］董怡.2002年修订的干燥综合征国际分类(诊断)标准［J］.中华风湿病学杂志，2002，6(4)：257.

　　［5］Perez P，Goicovich E，Alliende C，et al.Differential expression of matrix metalloproteinases in labial salivary glands of patients with primary Sjogren's syndrome［J］.Arthritis Rheum，2000，43：2807-2817.

　　［6］Gao L，Ding H，Chen L.The relationship between laminin and laminin receptor expression to me tastasis and surrival of breast carcinomas［J］.Zhonghua Binglixue Zazhi，1998，27(1)：31-34.

　　［7］Masui Asatsuma，Satoshi Ito，Mamorn Watanabe，et al. Increase in the ratio of matrix metallopro-teinase-9 to tissue inhibtor of metalloproteinase-1in saliva from patients with primary Sjogren's Syndome［J］.Clinia Chimica Acta，2004，345：99-104.

　　［8］Zucker S，Cao J，Chen WT.Critical appraisal of matrix metalloproteinase inhibitors in cancer treatment［J］.Oncogene，2000，19：6642-6650.

　　［9］Kerkela E，Saarialho-kere U.Matrix metalloproteinase in tumor progression：focus on basal and squamous cell skin cancer［J］.Exp Dermatol，2003，12：109-125.