作者：杨春，马晓强，何兰杰，张东，王立斌，杨银学
【摘要】 为探讨大肠癌与乳糖酶基因单核苷酸多态性的关系，利用聚合酶链式反应-限制性长度多态性分析(PCR-RFLP)技术，检测100例大肠癌患者及106例健康对照组乳糖酶基因C/T-13910位点的单核苷酸多态性，计算并比较各组基因型和等位基因频率，探讨二者之间的相关性。结果100例大肠癌患者及106例健康对照的基因型均为C/C型，病例组与健康对照组基因型相同。本研究尚未发现乳糖酶基因C/T-13910单核苷酸多态性与宁夏及周边地区人口大肠癌的发生有相关性。
【关键词】 乳糖酶；大肠癌；单核苷酸多态性；乳糖不耐受
目前，大肠癌在我国的发病呈上升趋势，对其发病原因的研究也在不断深入，有研究提示乳糖酶缺乏与大肠癌的发生发展有关［1］。本文通过聚合酶链式反应-限制性长度多态性分析(PCR-RFLP)技术，初步探讨宁夏及周边地区人群大肠癌与乳糖酶基因C/T-13910单核苷酸多态性的相关性，以期能在大肠癌的病因学方面有新的发现，为进一步预防和治疗该疾病提供依据。
1 材料与方法
1. 1 试剂和仪器
DNA提取试剂盒，购自北京赛百盛基因技术有限公司；根据LCT基因的基因序列设计并由北京赛百盛基因技术有限公司合成PCR扩增引物，上游引物：5'-TTT GTT GCA TGT TTT TAA TCT TTG GTA TGG G-3'，下游引物：① 5'-AGG AGA GTT CCT TTT GAG GCC AGG G-3'；②5'-AGG AGA GTT CCT TTG AGG CCA GGT-3'；Taq酶、dNTPs 、DNA Marker B、 Rsa Ⅰ内切酶、Gold ViewTM染色剂均购自北京赛百盛基因技术有限公司；PCR扩增仪(美国BIO-RAD公司生产)；DYCZ-24R双垂直电泳仪(北京市六一仪器厂生产)；Gel Doc 2000凝胶图像分析系统(美国BIO-RAD公司生产)。
1. 2 研究对象
1. 2. 1 病例组
2005年7月—2006年10月，宁夏医学院附属医院肛肠外科收治的100例大肠癌，均经病理学证实临床诊断。其中男51例，女49例，男女之比为1. 43∶1，年龄16～86岁。出生和长期生活在宁夏地区71列，周边地区29例，有三代以上回族血统9例，汉族91例。
1. 2. 2 对照组
近期无腹泻史及脓血便史，无消化道疾病史，无肠道手术史的前来宁夏医学院附属医院做健康体检者及本院健康职工共106人，年龄21～65岁，出生和长期生活在宁夏地区72例，周边地区34例，有三代以上回族血统36例，汉族70例。所有研究对象均按知情同意原则签署协议书。
1. 3 方法
1. 3. 1 模板DNA的提取
按DNA提取试剂盒说明书的步骤进行。提取的DNA置-20℃冰箱保存备用。
1. 3. 2 PCR扩增
取200μL薄壁管，加入反应体系(50μL)，进行第一步PCR循环，再以第一步PCR扩增产物为模板，加入反应体系，更换下游引物②，进行第二步PCR循环。两次PCR扩增的片断均为307bp。
1. 3. 3 酶切
取两步PCR扩增后的产物10μL，加入10×buffer及Rsa Ⅰ内切酶，放置恒温37℃水浴过夜后，酶切产物做8%的PAGE电泳判读结果。
1. 4 统计学方法
采用SPSS 11. 5统计软件进行卡方检验，P＜0. 05为差异有统计学意义。
2 结果
通过LCT基因的基因序列设计引物。经第一次PCR扩增后，2%琼脂糖电泳扩增产物长度为307bp。以第一次PCR扩增产物为模板，再次行PCR扩增后，2%琼脂糖电泳扩增产物长度为307bp，如图1。
加入Rsa Ⅰ内切酶经37℃水浴将扩增产物酶切后，8%聚丙烯酰胺电泳，100例大肠癌患者及106例健康对照的基因型均表现为C/C纯合子型(68bp、18bp、221bp)，如图2所示。病例组与对照组的基因型无不同。
3 讨论
目前，大肠癌的发病率呈现逐年增高的趋势，男女均处于恶性肿瘤的第3位，其中在西方发达国家，大肠癌的发病率处于第2位［2-3］。在我国大肠癌的发病率及死亡率约居恶性肿瘤的第4位，在城市死亡率列第2位。大肠癌是一种典型的环境生活方式癌，环境因素作用大于种族和遗传因素。目前，饱和脂肪酸作为大肠癌发病的危险因素已经被证实［4］。但牛奶作为营养品在结直肠癌的发病机理中的作用还不完全被人们所知道。乳糖(lactose)是奶类中特有的糖，几乎唯一地只存在于哺乳动物的乳汁里，人体对乳制品中乳糖的吸收是受位于小肠壁上的乳糖酶(lactase，LCT)活性的调控。乳糖经乳糖酶作用分解成葡萄糖和半乳糖后才能被小肠吸收利用。然而，正常人群中普遍存在不同程度的乳糖酶缺乏(lactase deficiency，LD)［5］，正常情况下，进入消化道的乳糖被小肠刷状缘细胞的乳糖酶水解为葡萄糖和半乳糖，这些单糖随即被小肠吸收，当乳糖酶缺乏时，未吸收的乳糖停留在肠腔内，引起水样腹泻、肠鸣、腹痛等症状，称之为乳糖不耐受(lactose intolerance，LI)。若临床无症状，只引起乳糖吸收障碍，则称之为乳糖吸收不良(lactose malabsorption，LM)［6］。
LD在全世界范围有明显的种族差异。黑人的发生率远高于白人。北欧白人LD的发生率为5%～10%，北美洲白人为10%～15%，北美洲黑人为70%～75%，非洲黑人为75%～100%，亚洲人为90%～100%。据我国调查，汉族成人LD发生率为75%～95%，少数民族亦有76%～95. 5%［7］。
随着分子生物学的发展，以基因单核苷酸多态性(Single Nnu-cleotide Polymorphism，SNP)预测易感人群已成为大肠癌基因诊治研究的重点之一，逐渐被人们所重视。分子流行病学研究已证实，乳糖酶的活性与位于13910位点上游序列中C/T单核苷酸多态性有关［8］。C/C-13910基因型普遍存在于成人型乳糖酶缺乏的人群中，属于常染色体隐性遗传。C/T-13910、T/T-13910基因型则与乳糖耐受有关，属于常染色体显性遗传［9］。在此基础上，H Rasinper等［10］又对确诊患有大肠癌的963名芬兰人、283名英国人和163名西班牙人乳糖编码基因第13910位的单核苷酸多态性进行研究，结果发现，基因型C/C-13910与芬兰人结直肠癌发病率有很大的相关性(P=0. 015)，但与年龄、肿瘤分期等没有关联。因此，Rasinper认为，乳糖酶基因第13910位C/C-13910基因型与体内乳糖酶的持续存在和高活性有关，并且该位点不同的基因型是导致芬兰人是否易患大肠癌的主要原因。但研究同时还指出，乳糖酶基因第13910位C/C-13910基因型与英国人和西班牙人的结直肠癌发病率无关。
本研究中，全部206例受试者的乳糖酶基因上游13910位点的单核苷酸多态性检测均为C/C型，即全部受试者均为乳糖酶缺乏，病例组与健康对照组基因型相同。此结果与国外相关文献报道存在差异，是否与所研究采样区域性狭小，样本量小有关外；还存在受试人群除是否长期饮用牛奶外，其他饮食结构相类似有关；总之通过此研究，尚不能得出乳糖酶基因C/T-13910单核苷酸多态性与宁夏及周边地区人口大肠癌的发生有相关性的结论，需进一步探讨。
参考文献
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［10］H Rasinpera C，Forsblom，NS Enattah，et al. The C/C213910 genotype of adult-type hypolactasia is associated with an increased risk of colorectal cancer in the Finnish population［J］.Gut，2005，54：643-64