作者：付雪艳， 董 琳， 马学琴， 张义伟， 武建军
【摘要】 目的 探讨卷柏对胰岛素抵抗大鼠肝脏胰岛素受体mRNA表达的影响。方法 动物分为5组，每组8只，阳性对照组给予盐酸二甲双胍片，给药组分别给予卷柏水提液及大孔树脂50%乙醇洗脱组分(简称50%组分)，用RT-PCR方法检测大鼠肝脏胰岛素受体mRNA表达水平。结果 阳性对照组、卷柏水提液、卷柏50%乙醇洗脱组分与模型组比较，大鼠肝脏胰岛素受体基因mRNA表达水平显著提高(P＜0.01)。结论 卷柏通过改善大鼠肝脏胰岛素受体基因mRNA表达而改善胰岛素抵抗。
【关键词】 卷柏；肝脏胰岛素受体；mRNA
卷柏为卷柏科植物卷柏Selaginella tamariscina(Beauv.)Spring及垫状卷柏S.pulvinata(Hook.et Grev.)Maxim.的全草。具有活血通经之功效，用于经闭痛经，症瘕痞块，跌扑损伤，本实验前期工作已经筛选了活性部位，证实其50%乙醇洗脱组分为活性部位［1］。本研究在此基础上，深入探讨了卷柏对胰岛素抵抗大鼠肝脏胰岛素受体mRNA表达的影响，为其机制的进一步研究提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 实验动物
清洁级雄性SD大鼠，雄性，体重180～220g，购自宁夏医科大学实验动物中心，动物生产许可证编号：SCXR(宁)2005-001，自由摄食和饮水，室温保持在(20±2)℃，湿度(50±1)%。适应性喂养1周。
1.2 试剂与材料
卷柏购自毫州药材市场，经宁夏药检所鉴定为卷柏。盐酸二甲双胍片，批号20070915，规格0.5g/片，杭州中美华东制药有限公司；AB-8型大孔吸附树脂，购自南开大学化工厂；rTaq酶，美国Promega公司；MgCl2、10×bufer、PCR Marker、Trizol试剂，美国Invitrogen公司。
Primer5.0软件设计，上游引物序列为5'-CCGGCGTGGCCTGCCCTCTGAT-3'，下游引物序列为5'-ATGATCACAGACTACCTGCT-3'，引物由上海博亚生物有限公司合成。β-actin(540bp)5'-GTCACCCACACTGTGCCCATC3'，5'ACAGAGTACTTGCGCTCAGGAG -3'。
1.3 样品制备
卷柏2kg，粉碎，水煎煮3次，每次1h，滤过，合并提取液，浓缩得浓膏(1mg/mL)。所得浓膏经大孔树脂柱层析(树脂与生药质量比为1∶1)，分别用水、50%乙醇洗脱，得各洗脱部位，弃去水洗脱部分，将50%乙醇洗脱液浓缩，备用。
1.4 实验方法
1.4.1 模型制备及分组 大鼠40只，体重180～220g，普通饲料适应性饲养1周，随机分为5组，分别为正常对照组、模型组、阳性对照组、卷柏水提液组、大孔树脂50%乙醇洗脱组分(简称50%组分)，每组动物8只。除正常对照组外，其余组大鼠1周后改喂高热量饲料制备动物模型(饲料组成：猪油15%，花生10%，蛋黄粉及糖、盐等，其余为基础饲料)10周［2］，自10周始，正常对照组和模型组灌胃(ig)给予等体积生理盐水，阳性对照组给予盐酸二甲双胍0.33g/(kg·d)，ig；治疗组分别给予卷柏水提液0.08g/(kg·d)，50%组分0.028 g/(kg·d)，ig，共给药2周(以临床剂量为依据，由人鼠换算公式及提取分离转化率换算而得)。末次给药2h后，将大鼠处死，取肝组织，迅速置-70℃冰箱冻存，备用。
1.4.2 总RNA提取 取冻存的肝组织约0.1g，采用Trizol试剂提取组织的总RNA，操作按说明进行。计算所提RNA量，使A260/A280比值保持在1.8以上。
1.4.3 cDNA的合成 取上述标本RNA 2μg，加入总量20μL下述混合液体。20μL反应体系：5×bufer 4.0μL；10mmol/L dNTP 2.0μL；逆转录酶0.5μL；上、下游引物各0.5μL，25mmol/L；MgCl21.5μL；RNA 2.0μg；加入去核糖核酸酶(Rnase)的蒸馏水至20μL。37℃ 反应1h，95℃ 5min灭活逆转录酶。合成好的cDNA置于-20℃备用。
1.4.4 RT-PCR检测肝脏胰岛素受体mRNA PCR扩增管中加总量25μL下述混合液。20μL反应体系：模板cDNA 1.0μL；5×缓冲液5.0μL；10mmol/L dNTP 2.0μL；rTaq酶1.0μL；上、下游引物各0.5μL；加入双蒸水至20μL。反应条件：94℃，30s；55℃，60s；68℃，60s，30个循环后，72℃延伸5min。
1.4.5 RT-PCR产物分析 取10μL PCR产物，1.0%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统下观察并记录拍照。采用Kodak2.0软件对PCR产物琼脂糖凝胶电泳进行扫描分析及数据处理。
1.5 统计学方法 用SPSS 12.0统计软件，结果以(±s)表示，两组样本间均数比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
各组β-actin扩增片段均为540bp；胰岛素受体基因mRNA为370bp片段，但各组电泳条带亮度有明显差异。与模型组比较，三个给药组均能增加胰岛素受体基因mRNA的表达(P＜0.05)，见表1、图1。表1 INSR/β-actin mRNA RT-PCR电泳产物灰度描比值的变化
3 讨论
卷柏水提液及其活性部位具有一定的降血糖及改善胰岛素抵抗的作用［3-5］，胰岛素抵抗又与胰岛素受体活性密切相关，胰岛素的作用是通过与靶细胞膜(脂肪细胞、肝细胞和肌细胞)表面的胰岛素受体结合后而实施的。典型的胰岛素作用部位是肌肉、脂肪和肝脏，胰岛素对靶细胞发挥生理作用，首先必须与位于胞浆膜上的受体结合。胰岛素与受体结合后，因受体构象发生改变而导致β亚单位自身磷酸化，由此该酶活性被激活，活化的胰岛素受体将通过胰岛素受体低物的磷酸化与含有Sh3区段蛋白质连接触发蛋白激酶、磷酸酶级联反应，实施胰岛素生物效应［6］，胰岛素受体基因是研究胰岛素抵抗的首要基因［7］。本实验证实，卷柏水提液及其活性部位能够提高肝脏胰岛素受体基因mRNA的表达，从而改善胰岛素抵抗。
参考文献
［1］ 付雪艳，董琳，马学琴，等.卷柏对大鼠胰岛素抵抗治疗作用的活性部位筛选［J］.宁夏医科大学学报，2009，31(1)：7-8.
［2］ 冯锋，董琳，张义伟，等.玉液汤治疗大鼠胰岛素抵抗实验研究(Ⅰ)［J］. 时珍国医国药，2008，19(4)：945-946.
［3］ 李方莲.卷柏对老龄糖尿病模型鼠的降血糖作用［J］.中国老年学杂志，1999，19(9)：301-302.
［4］ 于丽萍.单剂卷柏对FFR胰岛素敏感性的影响［J］.中成药，2001，23(4)：291-292.
［5］ 吴奕富.卷柏对链服佐菌素诱发搪尿病大鼠降血糖作用的研究［J］.福建中医药，2001，32(4)：42.
［6］ 贾伟平.胰岛素抵抗与受体［J］.第二军医大学学报，2003，24(5)：528-529.
［7］ 王军，吕文山.胰岛素抵抗的分子遗传学机制［J］.国外医学内分泌分册，2001，21(3)：133-136.