【摘要】 目的 确定并筛选用于特异静默单胺氧化酶B(Monoamine Oxidase B，MAOB)基因的干扰小RNA(siRNA)片段，建立RNA干扰技术平台。方法 构建含单胺氧化酶B基因siRNA片段的pSilencer 1.0-U6 siRNA 表达质粒，转染Hela细胞，用RT-PCR和定量PCR方法检测单氨氧化酶B mRNA的水平。结果 所设计的两段siRNA片段均有干扰MAOB mRNA水平的作用，片段2的作用优于片段1，两个片段之间有一定的协同作用。结论 选择的siRNA片段可以抑制Hela细胞单胺氧化酶B的表达。
【关键词】 RNA干扰，单氨氧化酶B；基因
单胺氧化酶B(Monoamine Oxidase B，MAOB)是一种线粒体酶，在脑内主要存在于基底核和中脑的神经元中，参与多巴胺代谢并被认为与神经退行性疾病帕金森氏症有关［1］。其抑制剂如Deprenyl、Eldepryl、Selegiline等是常用的抗抑郁药物和神经保护药物，所有单胺氧化酶B抑制剂都有不同程度的副作用［2］。本研究尝试用RNA干扰技术对单氨氧化酶B进行特异性的基因沉默，并尝试用这种低副作用的基因沉默技术替代传统的单胺氧化酶B抑制剂。现将使用RNA干扰技术对单胺氧化酶B进行基因表达抑制的实验结果报告如下。
1 材料方法
1.1 siRNA设计与质粒构建
以Genebank发表的MAOB mRNA 序列(NM_000898)为模板，用Ambion公司网上提供的专用设计软件设计了两段siRNA序列(19nt)，将设计好的特异片段与pSilencerTM1.0-U6质粒所需的结构片段连接起来，最终合成了四条两两互补的单链DNA序列如下：
第一对：以下命名为“MAOB-片段1”。
5'-AATTAAAAAAAGGGCAAATCATACCCCTTTCTCTTGAAAAGGGGTATGATTTGCCCTGGCC-3'(61BP)
5'-AGGGCAAATCATACCCCTTTTCAAGAGAAAGGGGTATGATTTGCCCTTTTTTT-3'(53BP)
第二对：以下命名为“MAOB-片段2”。
5'-AATTAAAAAAATATGTGGACCTTGGAGGATCTCTTGAATCCTCCAAGGTCCACATATGGCC-3'(61BP)
5'-ATATGTGGACCTTGGAGGATTCAAGAGATCCTCCAAGGTCCACATATTTTTTT-3'.
按照文献中提供的siRNA序列［4］设计并合成了针对绿色荧光蛋白GFP的两条互补的单链DNA如下：(以下命名为“GFP-片段”)
5'-AATTAAAAAAGGCTACGTCCAGGAGCGCATCTCTTGAATGCGCTCCTGGACGTAGCCGGCC-3'(61bp)
5'-GGCTACGTCCAGGAGCGCATTCAAGAGATGCGCTCCTGGACGTAGCCTTTTTT-3'(53bp).
将上述单链DNA用退火缓冲液溶解(1μg/μL)，在PCR仪上退火成双链(90℃ 3min，37℃ 1h)，然后将2μL(8ng/μL)双链DNA用T4 DNA链接酶和线性pSilencerTM1.0-U6质粒DNA(500ng)做链接反应(16℃过夜)。将连接好的纯化质粒转染到JM109大肠杆菌中，挑取克隆并用酶切法进行初步筛选，然后经DNA测序确定所选出的阳性克隆确实含有所设计的片段。富集扩增后提取质粒(Geno pure plasmid midi kit，Roche)，纯化定量备用。
1.2 细胞培养和质粒转染
将HELA细胞在24孔板(1×104/孔)中用含10％血清的DMEM培养，用Lipofectamine 2000(Invitrogen)按说明书将质粒DNA转入细胞中，48h后提取RNA。
为了监控质粒的转染效率，设计了GFP质粒转染组作为阳性对照组。将细胞培养在铺有载玻片的培养皿中，转染U6-RNAi空载或GFP-RNAi质粒和pIRES2-EGFP质粒，转染48h后用荧光显微镜观察绿色荧光，监测转染阳性率。同时平行进行MAOB-RNAi实验组的转染实验。实验组只转染U6-MAOB-RNAi质粒，并用其空载补齐即可。实验分组如下：
GFP对照组 A.不转染对照(control)；B.转染 pIRES2-EGFP 质粒对照(GFP-control)；C.以1∶1比例共转染 pIRES2-EGFP 质粒和U6空质粒的对照(RNAi-empty)；D.以 1∶1 比例共转染 pIRES2-EGFP 质粒和含"GFP片段"的U6质粒(GFP-RNAi+GFP-control)。
实验组分组 A.不转染对照(control)；B.转染U6空质粒对照(RNAi-empty)；C.转染含MAOB- 片段1 的质粒(MAOB-1)；D.转染含"MAOB- 片段2"的质粒(MAOB-2)。
1.3 RT-PCR
取上述培养的细胞用TRIZOL一步法提取总RNA。M-MLV逆转录试剂盒(GIBCO)合成cDNA用于PCR。用鼎国公司Taq酶在ABI9700PCR仪上进行PCR反应。2%琼脂糖凝胶电泳照相。PCR产物测序鉴定为所需片段(上海基康公司)。所用引物见图１。
1．4 定量PCR
用TaqMan Gold RT-PCR Kit(PE Biosystems)在ABI 7700型定量PCR仪上进行实时定量PCR反应。反应条件为：50℃ 5min；95℃ 5min，(95℃ 10s，60℃ 1min)40个循环。先用试剂盒中提供的人标准RNA(50ng/μL)进行逆转录然后再按浓度梯度进行GAPDH的定量PCR反应，经线性回归得到GAPDH的标准曲线。MAOB基因的表达量以此标准曲线进行换算。
实验分组如下：1.不转染对照。2.转染U6空质粒对照。3.转染含“MAOB- 片段1”的质粒。4.不转染对照。5.转染U6空质粒对照。6.转染含MAOB- 片段2的质粒。7.以1∶1 比例共转染“MAOB-片段1”质粒和含“MAOB-片段2”的质粒。
每组设三个平行管进行PCR扩增，测得Ct值按GAPDH标准曲线换算成MAOB/GAPDH取平均值并计算标准差，结果以柱形图表示。
PrimersProductAnnealingGAPDHF：5'- GAAGGTGAAGGTCGGAGTC -3'226bp60℃R：5'- GAAGATGGTGATGGGATTTC -3'P：5'-(TET)-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-(TAMRA)-3'.MAOBF：5'-CCAACCCAGAATCGTATCTTGA-3'126bp60℃R：5'-GGAATGGCCCCCTGAA-3'P：5'-(FAM)AGCGTCTGATCCACCATGTAAAGGGC(TAMRA)-3'GFPF：5'-ACCCCGACCACATGAAGCA-3'165bp60℃R：5'-CGATGCCCTTCAGCTCGAT-3'图1 RT-PCR和定量PCR引物
2 结果
2.1 RT-PCR结果
图2是转染RNAi质粒各实验组RT-PCR的结果，用以检测RNA干扰的效率。从图中可以看到转染含MAOB-片段1和2的质粒，以及共转染 pIRES2-EGFP 质粒和含“GFP片段”的U6质粒组都对各自的靶基因mRNA水平有一定程度的抑制，表明RNA干扰实验是成功的，所选择的两段针对MAOB的siRNA序列可以起到抑制MAOB基因表达的作用。
2.2 定量PCR结果
为进一步验证对MAOB基因表达的抑制作用，并定量比较两个片段的抑制效果，我们进行了定量PCR检测，见图3。结果显示“片段1”转染组MAOB的mRNA水平低于U6空质粒转染对照组，为U6空质粒转染对照组的72%，即其抑制效率为28%(比较图3中3和2)。而“片段2”转染组mRNA水平只有U6空质粒转染对照组的42%，即其抑制效率为58%(比较图3中6和5)。第7组实验是将两种片段的质粒按1∶1的比例混合后共转染细胞得到的结果。其MAOB的mRNA水平为空质粒转染对照组的33%，即其抑制效率为67%(比较图3中7和5)，高于单独转染的结果。
3 讨论
使用21个核苷酸的siRNAs 进行基因沉默方法的建立是一个里程碑。探索如何高效地将RNA干扰技术用于人类疾病治疗是这一类研究的最终目标。尽管这一技术的应用前景十分广阔，但一些关键性的问题则必须在临床应用之前解决。筛选出特异性的针对某个基因的siRNA片段是研究的第一步。而如何高效地将siRNA导入体内是这一技术应用的另一个难点。将siRNA导入细胞内的方法有两类，一类是直接将siRNA介入细胞内，一类是通过质粒转染的方法在细胞内表达siRNA［3］。
由于RNA易于降解，因此我们选择了通过构建质粒再转染细胞间接产生siRNA的方法。在这一实验体系中首先合成的是两条互补的DNA片段，不易降解。当把含有这一DNA片段的U6质粒转染进细胞中后，RNA 聚合酶III则以此为模板在细胞内合成特异的siRNA，从而达到沉默基因表达的效果。而最终沉默基因表达的效果依赖于两点，一是质粒转染细胞的效率，因为检测mRNA表达量的RT-PCR方法不能把转染和未转染的细胞区分开，因此如果转染效率较低，则静默基因表达的效果就会检测不出来。二是决定于所设计的siRNA片段的特异性。
为监测转染过程和转染效率，设计了绿色荧光蛋白的一组实验做为阳性对照。首先用pIRES2-EGFP 质粒转染细胞，被转染的细胞则带有绿色荧光，因为所使用的转染体系是一样的，表明pIRES2-EGFP 质粒和U6 siRNA 表达质粒的转染效率基本相同。本实验中只转染pIRES2-EGFP 质粒的绿色荧光阳性率约40%，因此我们推论U6 siRNA 表达质粒的转染效率也是约40%。另一组则用pIRES2-EGFP 质粒和含"GFP片段"的U6siRNA 表达质粒共转染细胞，由于所使用的含"GFP片段"的U6-siRNA 表达质粒不存在特异性问题，共转染后对绿色荧光的抑制效率基本上可以反映U6表达质粒的抑制效率。共转染组的绿色荧光阳性率只有约7%，经计算U6表达质粒的抑制效率约为80%。
转染质粒操作本身可能对细胞的生长产生一定影响，为此本实验设计了转染空质粒的对照组与转染U6 siRNA表达质粒的细胞进行比较。发现转染空质粒对mRNA的表达有一定的抑制作用，这一组绿色荧光的阳性率为35%，略低于阳性对照组。在计算RNA干扰抑制MAOB mRNA的比例时均以转染空质粒对照组为基数计算。
尽管以前认为siRNAs和其底物mRNA之间的结合是非常特异的，但近来研究发现siRNAs可以耐受在分子中部的一个碱基的突变，而要使这种结合作用完全失活则需要多达4个碱基的突变［4］。因此必须经过实验对所设计片段的特异性进行验证。这种序列的筛选是所有RNAi相关研究的第一步。为选择出对MAOB mRNA特异的siRNA序列，以Genebank发表的MAOB mRNA 序列(NM_000898)为模板，用Ambion公司网上提供的专用设计软件设计了一系列siRNA序列，经过Blast比对，并考虑到MAOB mRNA的5`端是编码酶活性区域的结构特征，最终选择了两段序列作为siRNA的模板。对这两段序列的RNA干扰结果进行比较表明，第一个片段的抑制效率为28%，第二个片段的抑制效率为58%，第二个片段明显优于第一个片段。两个片段的U6表达质粒进行共转染的抑制效率达到67%，表明确实存在协同效应。
目前人们已经开始尝试使用RNA干扰技术用于癌症、艾滋病、肝炎和帕金森病的临床治疗［5-6］。本实验结果表明通过RNA干扰技术可以达到抑制MAOB基因表达的目的。但要真正实现替代传统的MAOB抑制剂的目标，还必须解决以下几个问题。第一，siRNA介入体内的途径。第二，RNA干扰药物存在的形式，即以RNA还是以DNA或是以质粒或是以病毒上清等形式存在，这关系到这种方法最终能否用于临床。我们现在构建的U6表达质粒可以进一步用于今后动物实验的研究。
参考文献
［1］ Ruggieri S，Stocchi F，Denaro A，et al.The role of MAO-b inhibitors in the treatment of Parkinson's disease［J］. Journal of neural transmission，1986，22：227-233.
［2］ Mann JJ，Aarons SF，Wilner PJ，et al.A controlled study of the antidepressant efficacy and side effects of(-)-deprenyl.A selective monoamine oxidase inhibitor［J］. Archives of general psychiatry，1989，46：45-50.
［3］ Sui G，Soohoo C，Gay F，et al.A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells［J］. PNAS，2002，99：5515-5520.
［4］ Holen T，Amarzguioui M，Wiiger MT，et al.Positional effects of short interfering RNAs targeting the human coagulation trigger Tissue Factor［J］. Nucleic acids research，2002，30：1757-1766.
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［6］ Sioud M.Therapeutic siRNAs［J］. Trends in Pharmacological Sciences，2004，25：22-28