[关键词]线粒体脑肌病;高乳酸血症;卒中样发作综合征;基底节钙化;DNA
MELAS是线粒体病中一个常见的综合征，其临床特征有突发性偏瘫、头痛、恶心，同时可伴有身材矮小、智力低下、神经性耳聋等。颅脑CT可见双侧基底节钙化，约占30%～70%(主要在苍白球占30%～80%)，还可有脑梗死(其病灶范围与主要脑血管分布不一致)、脑室扩大、脑萎缩等。目前已知线粒体脑肌病是由线粒体DNA突变引起。为验证大部分MELAS综合征患者mtDNA突变位点在3243，进一步探索基底节钙化与mtDNA异常的关系，并探讨基底节钙化是否可作为线粒体病的筛选指标，笔者收集了20例有基底节钙化的MELAS综合征患者，并对这些患者的mtDNA片段进行检测，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 临床资料收集1999-2004年就诊于齐鲁医院神经内科有基底节钙化的MELAS综合征患者20例，其中男7例，女13例;年龄10～70岁，19例在40岁前发病，仅1例大于60岁，4例有家族史，2对为母子关系。20例中均有基底节钙化，肌肉病理均有不整边红纤维，电镜下可观察到异常线粒体。确诊为MELAS综合征。
1.2 实验方法
1.2.1 基因组DNA的提取用常规酚/氯仿法提取肌肉组织DNA，蛋白酶K-盐析法提取外周血DNA。
1.2.2 PCR的条件及检测方法 (1)引物设计:扩增A3243G的引物:上游引物:(5’-3’)3116~3135:CCTCCCTGTACGAAAGGACA;下游引物:(5’-3’)3609—3590:GCCTAGGGTIGAGGTrGACCA。扩增T3271C的引物:上游引物:同A3243G的上游引物。下游引物:(5’～3’)3301—3272:AATIECAGqL3ECAAGTrA-AGGAGAAGAAT;(2)PCR体系:10×Buffer(withMg2 mmol/L)10ul，模板DNA 2ul，Mixed dNTP(400 ul01)4ul，上游引物(400 pmol/L)4ul，下游引物(400 pmol/L)4 ul，Taq酶(5 U/100ul)1ul，其余体积用双蒸水补齐，PCR体系总体积100ul。(3)PCR循环:扩增:94度预变性3 min，94%变性1 min，56度退火1 min，72度延伸1 min，共30个循环，最后1个循环72度延伸10 min。(4)电泳:验证PCR产物。(5)PCR产物的纯化。(6)限制性片段长度多态性电泳上样缓冲液(Loading buffer)与10ul已酶切的PCR产物混匀，加入凝胶的上样孔中，同时在一上样孔加入5ul的DLl000 DNA marker。于1 xTAE环境、100 v电压，电泳60 min。电泳完毕，将凝胶置于AlphaImag-erTM2200型凝胶成像仪中显像，并将图像存入计算机。另一部分PCR纯化产物送上海生工生物技术有限服务公司测序，以验证PCR/RFLP结果。
2 结果
2.1 限制性内切酶酶切结果经APaI酶切13例检测到A3243G点突变，其余7例未检测到A3243G点突变，检测到突变的13例中4例为母子关系，20例均未检测到T3271C点突变。
2.2 侧序结果共14例检测到A3243G点突变，其中13例PCR/RFLP酶切显示有A3243G点突变者，测序均检测到A3243G点突变;l例酶切未显示A3243G点突变而测序检测到此点突变者，同时有C3524G、C3527T碱基置换。20例均无T3271C点突变，但有C3524G碱基置换者3例，有A3537G的碱基置换者1例，有C3527T碱基置换者5例，有C3527A碱基置换者1例，有C3527G碱基置换者2例，C3497A碱基置换者4例。
3 讨论
线粒体病是由于线粒体功能异常而导致各种代谢过程异常的一组疾病。常见的线粒体病临床综合征为:线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作综合征(MELAS)、肌阵挛陛癫痫伴不整红边纤维综合征(MERRF)、慢性进行性眼外肌麻痹(CPEO/KSS.)、Leber遗传性视神经病(LHON)和Lei曲综合征。文献报道 MELAS综合征中基底节钙化的发生率为30%-70%(且主要在苍白球，约占30%一80%)，多呈对称性分布，而MELAS综合征线粒体的tRNAv“(uort)基因(即A3243G点)是线粒体基因突变的“热点”，约占80%。因此，我们设计的引物在于扩增该区域。由于突变型mtDNA A3243G点突变产生了一个新的Apal~切位点，而野生型mtDNA无此酶酶切位点，因此，应用扩增A3243G的引物行PCR反应结束后，再用ApaI酶切，野生型mtDNA只有494 bp处一个条带，而突变型mtDNA因为A3243G点突变产生了一个新的Apa墙每切位点，所以被切成366 bp和128 bp，两个片段。在琼脂糖凝胶电泳时可见到366 bp和128 bp处两个新的条带。在本研究的20例患者中，13例通过酶切检测到A3243G点突变，且均为异质性突变。侧序结果显示20例病例中，14例有A3243G点突变，其中，13例PCR/RFLP酶切显示有A3243G点突变者，测序均检测到A3243G点突变;1例酶切未显示A3243G点突变而测序检测到此点突变者，同时有C3524G、C3527T碱基置换。提示PCR-RFLP检测中有假阴性结果，这可能与突变碱基周围的碱基序列的变异性有关，有待于进一步研究证实。 CM Sue等报道了他们研究的26例有A3243G点突变的MELAS综合征病例中14例有基底节钙化，也说明了基底节钙化是MELAS综合征病例的最常见
的影像学表现。结合我们的研究可以推测:基底节钙化与线粒体DNA基因突变所导致的能量代谢异常有密切关系。20例病例中有两对母子，且都有A3243G点突变，1对母子表现为癫痫发作、失明、失聪，另一对母子表现为糖尿病和耳聋症状，说明了MELAS综合征的母系遗传特性以及临床表现的多样性，母亲一旦发生了mtDNA突变，就很容易传递到下一代。这提示我们如果发现母子同时有基底节钙化要想到线粒体病的可能。
我们的侧序研究还发现3524、3527、3497和3537位点的碱基置换，这些碱基置换均位于编码还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶基因的区域(3305-4262)内，而NADH脱氢酶是构成线粒体呼吸链酶复合体I的7个亚基之一，因此，这些位点的碱基置换是否影响能量代谢过程以及与基底节钙化的关系还有待于进一步研究。Matsumoto M等报道，3497位点的碱基置换常同时有G11778A点突变，A11778G点突变是Leber’遗传性视神经病(LHON)的常见突变位点，3497位点被认为是LHON的第2个常见突变位点。上述碱基置换与MITOMAP:MtDNACoding Region Sequence Polymorphisms(Last editedMay 16，2005)比对证明，这些碱基置换除A3537G外均非多态性，但由于是和国外的资料做的比较，这些位点的碱基置换是否就是中国人的致病性点突变还有待于和120例正常对照相比较。
CM Sue等研究的26例有A3243G点突变的MELAS综合征病例中，发生基底节钙化的年龄范围为17~76岁，平均54岁。基底节钙化的发生率随时间的推移而增高，而且没有任何临床特征提示，14例患者的血清钙离子浓度均在正常水平，有6例检测了血清中降钙素的浓度，也均在正常水平。他们的研究揭示了基底节钙化的发生与血清钙和降钙素浓度的高低无明显关系。
目前认为，基底节钙化是MELAS综合征最常见的神经影像学异常，绝大多数为苍白球部位钙化，文献报道钙化还可见于尾状核、豆状核、丘脑、内囊等处。基底节钙化的发生年龄范围广，从10岁到70余岁不等，究其原因可能为随着年龄的增长，功能异常的线粒体不断累积，能量代谢障碍逐渐加重，从而导致钙盐沉积。本研究20例患者均在40岁以下，血钙、血磷除1例异常外均在正常范围内，提示基底节钙化与血钙关系不大。这与国内外文献报道基本一致。我们的研究显示:20例病例中，14例有A3243G点突变，4例有C3497A点突变，还有3524、3527位点的碱基置换，再者，已经明确有200多个点突变可导致线粒体病，我们仅对3243位点进行扩增，不能排除其他位点突变的可能，而仅A3243G点突变的发生率就达到70%。因此，我们推测基底节钙化的发生与线粒体基因突变导致的能量代谢障碍有密切关系，有理由把基底节钙化作为线粒体病的一个有意义的筛选诊断指标。不足之处是我们的病例数少，未能做统计学分析。
因此，我们得出结论:大部分MELAS综合征患者mtDNA突变位点在3243;基底节钙化与mtDNA异常关系密切，年轻患者的基底节钙化可作为线粒体病的筛选诊断指标。临床疑诊为线粒体病患者，建议进行肌肉活组织检查、酶组织化学染色，并查血乳酸水平，以减少线粒体病的漏诊、误诊。我们所用的PCR—RFLP方法操作简便，结果明了，实用性强，结合mtD-NA序列分析，能更进一步提高线粒体病的检出率，并确定突变位点。
参考文献
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