【摘要】 目的 构建人类错配修复基因hMLH1和hMSh3错义突变真核表达载体并检测它们在瞬时转染细胞中的蛋白表达。方法 重组pcDNA3.1-hMLH1-wt和pcDNA3.1-hMSh3-wt质粒为模板，用定点诱变的方法分别构建hMLH1基因和hMSh3基因错义突变真核表达载体，将诱变前后的重组质粒瞬时转染至HCT-116细胞(hMLH1基因缺陷型)或LoVo细胞(hMSh3基因缺陷型)中，免疫印迹法和免疫荧光法分别检测这两种基因在各自的转染细胞中的蛋白表达。结果 测序证实，定点突变成功，构建出hMLH1基因错义突变pcDNA3.1-hMLH1-T117M和pcDNA3.1-hMLH1-V384D真核表达载体以及hMSh3基因错义突变pcDNA3.1-hMSh3-L390F、pcDNA3.1-hMSh3-Q419K 和pcDNA3.1-hMSh3-Q629R真核表达载体。结果表明转染后，除hMLH1-T117M突变体蛋白表达缺失外，其余的野生型及突变型真核表达载体在转染细胞中均能表达相应的蛋白。结论 成功构建了在人的肿瘤细胞系中能有效表达的两种hMLH1基因错义突变和三种hMSh3基因错义突变的真核表达载体，为进一步研究这些错义突变的病因学作用和功能意义奠定了实验基础。
【关键词】 hMLH1;hMSh3;错义突变;定点突变;真核表达载体;转染;蛋白表达
遗传性非息肉性结直肠癌(HNPCC)，又称Lynch综合征，是一种由错配修复基因(mismatch repair gene，MMR)发生胚系突变造成的常染色体显性遗传性肿瘤，约占结直肠癌总数的5%～15%[1-2]。HNPCC的发病与人类错配修复基因功能异常密切相关，hMLH1和hMSh3基因突变在HNPCC病人总突变中占90%以上，是导致HNPCC发病的主要原因[3]。在临床诊断上尽管阿姆斯特丹标准对HNPCC的发病特点做了较为明确的描述[4]，但由于HNPCC患者缺乏明显的临床指征，误诊率高，因此HNPCC的确诊还有赖于错配修复基因胚系病理性突变的检出。在hMLH1和hMSh3基因突变谱中，大约三分之一的突变属于错义突变[5-6]。相对于大多数导致截短蛋白的恶性突变，这种单个氨基酸改变的错义突变对蛋白功能的影响往往差异较大，因此对这些错义突变进行功能评估，明确其属于无害突变还是病理性突变，其基因功能是部分受到影响还是完全表达失活，在分子病理学诊断上具有重要意义。鉴于此，本文选择在华人中疑似HNPCC家系中发现的五种错义突变，即hMLH1基因的T117M和V384D以及hMSh3基因的L390F、Q419K和Q629R，采用定点突变技术构建其真核表达载体，并用免疫印迹法和免疫荧光法对转染细胞进行蛋白表达分析，为进一步研究这些错义突变的病因学作用和功能意义，评估其可能的临床意义奠定实验基础。
1 材料和方法
1.1 材料
人结肠癌LoVo细胞株和HCT-116细胞株均购自美国ATCC(American type culture collection)。重组质粒pcDNA3.1-hMLH1-wt和 pcDNA3.1-hMSh3-wt由德国法兰克福 JW Goethe大学附属医院Stefan Zeuzem博士惠赠。质粒pcDNA3.1+(V790.20)购自美国Invitrogen公司。定点突变试剂盒QuikChange Site-directed Mutagenesis kit购自美国Stratagene公司，质粒提取试剂盒QIAGEN Miniprep Kit购自德国QIAGEN公司。Fugene 6 转染试剂购自美国Roche公司。免疫印迹分析所用一抗hMLH1单克隆抗体(Clone：G168-728)和hMSh3单克隆抗体(Clone：27)均购自美国BD Biosciences公司。β-actin抗体(CLONE AC-15)购自美国Sigma公司。二抗辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG，增强型ECL试剂盒和硝酸纤维素膜均购自美国Amersham Biosciences公司。用于免疫荧光分析的二抗Alexa Fluor 488 Gt A-Mo IgG(H+L)购自美国Invitrogen公司。荧光倒置显微镜为日本的Nikon ECLIPSE TE2000-S。用ABI 3130 DNA测序仪(美国应用生物系统公司)进行测序。
1.2 细胞系及培养
LoVo细胞用RPMI-1640培养基，HCT-116细胞用McCoy's 5A培养基。培养基含10%胎牛血清、100u·mL-1青霉素和100u·mL-1链霉素。在37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。
1.3 表达载体的构建及定点突变
重组pcDNA3.1-hMLH1-wt和pcDNA3.1-hMSh3-wt质粒为模板，根据公布的hMLH1基因序列(NM_000249.2)和hMSh3基因序列(NM_000251.1)以及定点诱变的要求分别设计合成了含有预期突变位点的五对定点突变引物，突变引物序列如下：hMLH1-T117M正向引物为5'-GGCTCATGTTACTATTACAATGAAAACAGCTGATGGAAAG
TG-3'，反向引物为5'-CACTTTCCATCAGCTGTTTTCATTGTAATAGTAACATGAGCC-3';
hMLH1-V384D的正向引物为5'-TATGCCCACCAGATGGATCGTACAGATTCCCG-3'，反向引物为5'-CGGGAATCTGTACGATCCATCTGGTGGGCAT
A-3';hMSh3-L390F正向引物为5'-TCCCAGATCTTAACCGATTTGCCAAGAAGTTTCAAAGAC-3'，反向引物为5'-GTCTTTGAAACTTCTTGGCAAA
TCGGTTAAGATCTGGGA-3';hMSh3-Q419K正向引物为5'-ATAAATCAACTACCTAATGTTATAAAG
GCTCTGGAAAAACATGAAGG-3'，反向引物为5'-CCTTCATGTTTTTCCAGAGCCTTTATAACATTAGGTAG
TTGATTTAT-3'以及hMSh3-Q629R正向引物为5'-CAGCCATTTTGGAGAAAGGACGAGGAAGAATTA
TATTAAAAGCATC-3'，反向引物为5'-GATGCTTTTAATATAATTCTTCCTCGTCCTTTCTCCAAAAT
GGCTG-3'。其中下划线为预期突变的密码子，粗体为引入突变的核苷酸，按照Stratagene公司的QuikChange Site-directed Mutagenesis kit 试剂盒使用说明进行定点突变反应。50μL的含pfuTurboDNA多聚酶的热循环反应体系在95 ℃变性30s后，95 ℃变性30s，55 ℃退火1min，68 ℃延伸8min，经过12个扩增循环后，用限制性内切酶Dpn I 特异性切除甲基化的模板DNA。将带缺口的突变质粒转化到E.coli.XL1-Blue感受态细胞中，用Amp抗性LB平板筛选阳性克隆，用QIAprep Spin Miniprep Kit试剂盒进行质粒提取，用ABI 3130 DNA测序仪进行测序以验证是否正确引入预期突变并冻存剩余菌液。
1.4 转染
以hMLH1基因野生型及两种错义突变的真核表达载体分别转染HCT-116细胞，以hMSh3基因野生型及三种错义突变的真核表达载体分别转染LoVo细胞。在转染前1d，用无血清培养基以1-3×105·mL-1细胞密度接种于6孔培养板，每孔2mL，于37 ℃，5% CO2培养箱培养24h，待细胞汇合度达60%～80%时，按每孔2μg的质粒DNA与6μL的Fugene 6转染试剂即3∶2的比例转染细胞。空转染对照组不含质粒DNA，阳性对照组为重组的野生型质粒，阴性对照为pcDNA3.1+质粒。培养6h后，更换含有血清的全培养基继续培养以进行后续的免疫印迹分析和免疫荧光分析。
1.5 免疫印迹(Western blot)
收获转染48h后的各组细胞，按下述方法分别提取细胞核蛋白并进行SDS-PAGE胶蛋白电泳，免疫印迹法检测这些蛋白在瞬时转染细胞中的表达，β-actin抗体为内参对照。
细胞裂解液的制备：收集培养的细胞，以预冷的PBS漂洗2次，以1000 r·min-1离心5min，弃上清，分别用裂解缓冲液A(10 mM HEPES，pH 7.9;10 mM KCl;1.5 mM MgCl2;1 mM DTT 和 1 mM PMSF)冰浴15min裂解细胞，4℃下12000 r·min-1离心20s，弃上清。用含有1倍蛋白酶抑制剂混合物的裂解液B(20 mM HEPES，pH 7.9;420 mM NaCl;1.5 mM MgCl2;0.2 mM EDTA;20% Glycerol;1 mM DTT 和 1 mM PMSF)重新悬浮核沉淀物，4℃孵育30min后，12000 r·min-1离心5min，取上清。
取30μg的等量蛋白用8%十二烷基硫酸钠-聚丙酰胺凝胶(SDS-PAGE)进行分离，电转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭过夜。一抗为鼠源的hMLH1单克隆抗体以及鼠源的hMSh3单克隆抗体，1∶250稀释，β-actin抗体为内参对照，室温孵育1h，PBST 洗膜。二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG，1∶10 000稀释，室温孵育1h，PBST洗膜。增强型ECL试剂盒显色，暗室曝光显影。
1.6 免疫荧光分析
当细胞在盖玻片上爬片生长至大约60%融合度时进行细胞转染，48h后收获细胞。PBS洗2遍，用100%预冷的丙酮在-20℃固定过夜。PBS洗3遍，用0.5%的 Triton X-100/PBS室温处理10min以增加细胞的渗透性。PBS洗3遍，用封闭缓冲液(PBS;1%BSA;0.2%Tween 20;5mM Tris/HCl，pH7.6)室温封闭1h。PBS洗后，分别结合一抗和二抗。一抗为鼠源的hMLH1单克隆抗体以及hMSh3单克隆抗体，使用浓度为1∶250;二抗为Alexa Fluor 488 标记的羊抗鼠IgG(H+L)，使用浓度为1∶400，室温下避光孵育1h后封片，用荧光倒置显微镜进行观察拍照。
2 结果
2.1 表达载体的构建及定点突变
hMLH1基因位于人类染色体3p21.3，其基因组全长58.14kb，有19个外显子组成，包含2 268bp的开放阅读框，编码含756个氨基酸残基组成的蛋白。突变位点T117M和V384D分别位于外显子4和外显子12上。hMSh3基因位于人类染色体2p21-22，其基因组全长73kb，含16个外显子。其cDNA全长3 111bp，含有2 727bp的开放阅读框，编码909个氨基酸组成的蛋白质。突变位点L390F、Q419K以及Q629R分别位于外显子5、外显子7和外显子12上。
构建了含预期突变位点的错义突变表达载体。DNA测序证实(图1、2，见封3)，hMLH1基因中117位点的苏氨酸(ACG)点突变成甲硫氨酸或起始密码子(ATG);384位点的缬氨酸(GTT)点突变成天门冬氨酸(GAT)。同样，hMSh3基因中390位点的亮氨酸(CTT)突变成苯丙氨酸(TTT);419 位点的谷氨酰胺(CAG)突变成赖氨酸(AAG)以及629位点的谷氨酰胺(CAA)突变成精氨酸(CGA)。序列分析表明，除特定碱基位点被突变的碱基替换外，其它序列和野生型序列完全保持一致。因此成功构建了hMLH1基因错义突变pcDNA3.1-hMLH1-T117M和pcDNA3.1-hMLH1-V384D真核表达载体以及hMSh3基因错义突变pcDNA3.1-hMSh3-L390F、pcDNA3.1-hMSh3-Q419K 和pcDNA3.1-hMSh3-Q629R真核表达载体。
2.2 Western 免疫印迹法检测结果
Western 免疫印迹分析结果(图3、4)表明，除
转染的表达质粒为A：pcDNA3.1-hMLH1-wt野生型阳性对照;
B：pcDNA3.1质粒阴性对照;C：pcDNA3.1-hMLH1-T117M突变体;
以及D：pcDNA3.1-hMLH1-V384D突变体。β-actin为内源对照。
图3 构建的hMLH1真核表达载体转染HCT-116
细胞48h后的蛋白免疫印迹结果
hMLH1-T117M突变体蛋白表达缺失外，其余的野生型及突变型的转染质粒在细胞中均有表达。蛋白大小与预期相符，野生型的蛋白表达量略高于它们相应的突变体。
2.3 免疫荧光检测结果
免疫荧光检测结果和Western检测结果基本相符(图5，见封3)。
3 讨论
hMLH1和hMSh3基因突变是遗传性非息肉性结直肠癌发病的直接原因，其中错义突变约占已检突变的三分之一。因此建立有效的错义突变功能评估体系，确定检出突变的病因学作用具有重要意义。
hMLH1基因错义突变T117M是我们在一个早年患大肠癌的华人先证者中发现的，家族中有3名直系亲属病理证实患Lynch氏症相关之癌症，具有明显的家族史和微卫星不稳定性，因此推测它是一个恶性突变[7]。该突变位点位于hMLH1基因的一段能与hPMS2相互作用的高度保守区，蛋白功能研究表明hMLH1-T117M突变体不能与hPMS2互动，丧失其错配修复功能[8]。在我们的实验中，免疫印迹法没有检测到T117M突变体蛋白的表达，免疫荧光法也只检测到微弱的表达。hMLH1基因V384D突变在大肠癌患者和健康人群中均有发现，其病因学作用不清，可能是仅限于东亚人群中与HNPCC相关的非功能多态性[9]。
hMSh3基因L390F、Q419K和Q629R突变是在华人中发现的错义突变。在hMSh3基因突变检测中，Q419K和Q629R突变仅在华人大肠癌患者中发现，而在健康人群中未能检出。携带这3种错义突变的患者其家族成员至少有2位患Lynch氏症相关之癌症[10]，其病因学作用目前尚不清楚。
错配修复基因突变会引起修复功能缺陷，从而产生遗传不稳定性，导致肿瘤和癌症的易患。这些错义突变的病因学作用和功能意义的阐明对我们加深理解HNPCC的发病机制，更好地为HNPCC高危家系提供基因诊断和遗传咨询，具有重要的临床指导意义和应用价值。毫无疑问，病因学作用和功能意义的阐明最终要得到肿瘤遗传流行病学研究结果和蛋白质功能实验证据的支持。本实验hMLH1和hMSh3基因错义突变真核表达载体的成功构建，为下一步研究突变基因的功能，评估其可能的临床意义奠定了实验基础。
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