纳洛酮对少突胶质细胞的保护作用

　　　　 作者：王银 李云鸿 滕鹏 苗珍花 杨文君 李博

【摘要】 目的研究纳洛酮(naloxone)对脂多糖(lipopolysacchar，LPS)激活的小胶质细胞诱导少突胶质细胞损伤的影响。方法 共培养大鼠小胶质细胞和少突胶质细胞，用LPS(1μg·mL-1)刺激小胶质细胞，随后用0.1μM纳洛酮进行干预，应用免疫组化方法观察计数少突胶质细胞。结果 仅用0.1μM 纳洛酮处理细胞，细胞活性基本保持不变，而当小胶质细胞被LPS激活后，与之共培养的大量的少突胶质细胞死亡(P&<0.01);小胶质细胞被LPS激活，给予0.1μM纳洛酮处理后，少突胶质细胞的活细胞数显著升高(P&<0.05)。结论 纳洛酮能够抑制LPS激活的小胶质细胞引起的少突胶质细胞的损伤。

【关键词】 纳洛酮;少突胶质细胞;小胶质细胞; LPS

纳洛酮又名丙烯吗啡，为羟二氢吗啡酮衍生物，是专一的吗啡受体拮抗剂，与阿片受体呈立体专一性结合。纳洛酮与阿片受体亲和力远大于吗啡及脑啡肽，因此纳洛酮在临床上被作为阿片类药物中毒的治疗首选药物，用于麻醉镇痛药和非麻醉镇痛药过量、新生儿缺血缺氧性脑病等[1]。少突胶质细胞是中枢神经系统的髓鞘形成细胞，在临床上与一些中枢神经系统疾病尤其是新生儿相关疾病密切相关[2]。小胶质细胞在中枢神经系统的免疫反应中发挥核心作用。在感染因素如LPS等的刺激下，小胶质细胞被迅速激活。活化的小胶质细胞可释放各种促炎性细胞因子，诱导少突胶质细胞的凋亡。本研究通过检测特异性抗原CD11和O4鉴定小胶质细胞和少突胶质前体细胞，观察纳洛酮对激活的小胶质细胞诱导的少突胶质细胞损伤的抑制作用，旨在对纳洛酮的临床应用提供一定的实验室依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验材料 LPS、纳洛酮、抗CD11抗体(小鼠IgG1 mAb)、抗O4抗体(小鼠IgG1 mAb)购自Sigma公司;Transwell购自密理博公司。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 小胶质细胞和少突胶质细胞的分离和培养 取1d龄的新生大鼠脑，去除结缔组织和血管，机械捣碎并通过70μm网筛过滤，分离的细胞种植到多聚赖氨酸包被的培养瓶中，培养于含20%小牛血清的DMEM培养液，37℃，5%CO2恒温箱培养。每3天换1次细胞液。2周后，利用摇床振荡法分离纯化小胶质细胞和少突胶质细胞，分离的小胶质细胞种植于Transwell中，加含10%小牛血清的DMEM;少突胶质细胞则种植到24孔板内的载玻片上，培养液为含有N2 、10μg·mL-1 PDGF 和 25μg·mL-1 bFGF 的无血清DMEM溶液。第2天，将长有小胶质细胞的Transwell转移到长有少突胶质细胞的24孔板上共培养，培养液为含10%小牛血清的DMEM。

　　1.2.2 免疫细胞化学法检测CD11、O4 小胶质细胞和少突胶质细胞分别培养在24孔板内的无菌载玻片上24 h，然后用预冷的PBS漂洗少突胶质细胞1次，4%多聚甲醛固定30 min;PBS漂洗3次;分别加入1∶200稀释的抗CD11单抗(CD11作为小胶质细胞标记物)、抗O4单抗(O4作为少突胶质细胞标记物)孵育过夜，然后再用PBS漂洗5 min×3，最后加入荧光Alex-488偶联的辣根过氧化酶标记的二抗(1∶1000)，室温孵育1 h，加入细胞核的特异性染料DAPI，孵育5 min，PBS漂洗5 min×3，封片，在荧光显微镜下观察。细胞呈绿色者为阳性细胞，应用J EOR801D 形态学图像分析系统软件，每片随机取4个视野，记录阳性细胞数， 与正常对照组或LPS组细胞数相比较。

　　1.2.3 细胞分组与处理 小胶质细胞和少突胶质细胞共培养24 h后，分为4组，即对照组、LPS组、纳洛酮组和LPS加纳洛酮组。对照组不做任何处理，LPS组用LPS(1μg·mL-1)处理4 h，纳洛酮组用0.1μM纳洛酮处理18 h，LPS 加纳洛酮组先用LPS(1μg·mL-1)处理4 h，再用0.1μM纳洛酮处理18h。处理用LPS、纳洛酮均加于上层培养小胶质细胞的Transwell中，各组处理完毕，移去Transwell，对下层各组少突胶质细胞进行免疫细胞化学分析，每个点做3个平行。重复试验3次。

　　1.2.4 统计学方法 实验数据以均数±标准差(±s)表示。各实验组间比较用单因素方差分析(one way ANOVA)，P&<0.05表示差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 小胶质细胞和少突胶质细胞的鉴定及共培养系统

　　利用摇床振荡法分离纯化小胶质细胞和少突胶质细胞，分别培养在载玻片上，用抗CD11单抗(CD11作为小胶质细胞标记物)、抗O4单抗(O4作为少突胶质细胞标记物)及细胞核染料DAPI对细胞的纯度和活性进行鉴定。在荧光显微镜下观察到分离、培养的小胶质细胞，细胞体积小、折光性强、圆形，一些细胞有短的突起，CD11阳性呈绿色;少突胶质细胞胞体呈椭圆形或圆形，具有典型的双极突起，少数呈三极突起，阳性细胞呈绿色，两种细胞的纯度均达到99%以上，说明此研究所用的摇床振荡分离纯化法分离培养的小胶质细胞和少突胶质细胞非常成功，为下一步的共培养提供了实验基础(图1，见封2)。

　　2.2 纳洛酮对小胶质细胞激活所诱导的少突胶质细胞凋亡的抑制作用

　　仅用0.1μM 纳洛酮处理细胞，细胞数目基本保持不变(预试过不同浓度纳洛酮对细胞的毒性作用后选此浓度用于实验)，而当小胶质细胞被LPS激活后，与之共培养的大量的少突胶质细胞死亡(P&<0.01);LPS激活后，给予0.1μM纳洛酮处理后，少突胶质细胞的数目显著升高，P&<0.05(图2A、B，见封2)。

　　3 讨论

　　小胶质细胞是中枢神经系统常驻细胞，行使支持、营养、免疫监视等多种功能。小胶质细胞在受到感染、外伤等因素刺激后活化，产生多种免疫效应分子，包括白细胞介素、肿瘤坏死因子、干扰素γ、活性氮、活性氧等。这些因子介导慢性炎症反应、细胞凋亡等，是导致神经系统退行性病变如早老性痴呆、帕金森病等的主要因素[3-5]。体外实验证明，活化的小胶质细胞能借助NO机制使少突胶质细胞溶解[6-8]。 而少突胶质细胞是神经元的髓鞘形成细胞，在很多神经性疾病中起着至关重要的作用，例如，早产儿脑室周围白质软化的发病机制主要是由于缺血和感染导致脑室周围白质的少突胶质前体细胞受损和死亡，致使脑白质内髓鞘不能形成，临床上显现脑瘫和智能落后等后遗症[9-10];多发性硬化症是一种慢性、炎症性、脱髓鞘的中枢神经系统疾病，少突胶质细胞受损和死亡，逐渐造成大脑和脊髓的斑块性神经髓鞘的破坏(脱髓鞘)，髓鞘的瘢痕形成影响神经轴突的信号传递，以失去大脑和脊髓对外周的控制，以至多部位的僵硬或丧失功能[11-12]。

　　由于在炎症介导的神经退行性变中，小胶质细胞的活化及其分泌的细胞因子起到至关重要的作用，因此目前对于这类疾病治疗的研究工作也有很大一部分是针对抑制小胶质细胞活化和细胞因子的分泌[13]。纳络酮是一种非选择性G蛋白偶联的阿片受体拮抗剂，广泛分布于中枢神经系统和外周。在大鼠中脑神经元-胶质细胞联合培养体系中，纳络酮抑制LPS 活化的小胶质细胞，明显减少多巴胺神经元的退行性变;在炎症介导的啮齿类动物帕金森模型中，纳络酮已被确定有神经保护作用。 研究表明纳洛酮对抑制小胶质细胞的激活并减少LPS 刺激后产生的TNF-α、IL-1β、NO 和超氧自由基均有效 [14]。本实验中纳洛酮对LPS激活小胶质细胞诱导的少突胶质细胞损伤的抑制作用，可能就是通过抑制小胶质细胞活化后炎性因子的释放而完成的，其具体的机制还需进一步的研究。

　　本次实验结果表明，纳洛酮能有效抑制LPS激活的小胶质细胞诱导的少突胶质细胞的损伤，对于中枢神经系统慢性退行性疾病的预防及治疗有着良好的应用前景。但是，纳洛酮对少突胶质细胞保护作用的分子机制及通路亟待进一步的研究。

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