作者：赵薇， 丁娟， 芦晓红， 李燕， 李建宁
【摘要】 目的观察氧化苦参碱对家兔激素性股骨头缺血坏死的保护作用。方法 50只青紫兰家兔随机分为5组：空白对照组、模型对照组(醋酸泼尼松龙)、氧化苦参碱10、20、30 mg·kg-1三个剂量组，经不同剂量氧化苦参碱预处理后给予大剂量糖皮质激素诱导发生股骨头坏死。通过股骨头的病理改变来评价氧化苦参碱对激素性股骨头坏死的保护作用。通过RT-PCR和Western blot实验检测股骨头组织中VEGF的表达来讨论其可能机制。结果 中、高剂量氧化苦参碱预处理组的家兔股骨头组织中未观察到明显的缺血坏死改变，且同时伴有VEGFmRNA和蛋白表达水平的增高。结论 氧化苦参碱对家兔激素性股骨头坏死病变有保护作用，可上调组织中VEGF的表达。
【关键词】 氧化苦参碱;激素性股骨头坏死;VEGF
有研究表明近年来临床糖皮质激素所致激素性股骨头坏死的比例逐年上升[1]，有必要寻找一种安全有效的方法在使用激素的过程中预防股骨头坏死。氧化苦参碱(Oxymatrine， OMT)主要用于慢性乙型肝炎的辅助治疗[2]。近期研究显示OMT具有舒张血管和保护血管内皮的作用[3]，而股骨头坏死正是由于血管生成障碍、血供不足所致。所以理论上OMT具有潜在的加强血供的作用，但其对股骨头缺血坏死是否有保护作用尚无报道。由于血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor， VEGF)是反应股骨头缺血坏死中血管因素的重要指标，所以本实验旨在观察OMT对糖皮质激素所致家兔股骨头缺血坏死及股骨头组织VEGF表达的影响。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验药品 氧化苦参碱注射液，宁夏绿谷药业有限公司生产(0.2g·2mL-1，批号：20070402)。
1.1.2 实验动物 青紫兰家兔2.0～2.5 kg，雌雄不拘，由宁夏医科大学实验动物中心提供。
1.1.3 试剂 Trizol试剂盒和RT-PCR试剂盒购自上海雷浩信息科技有限公司，VEGF165鼠单克隆抗体和HRP-羊抗鼠IgG抗体购自北京中山生物技术公司。
1.2 实验方法 将青紫兰家兔随机分为5组，每组10只，分别为空白对照组、模型对照组、OMT组。OMT组家兔分别耳静脉注射 10、20、30 mg·kg-1OMT，空白组和模型组给予NS，容量均为5 mL·kg-1。10min后臀肌注射醋酸泼尼松龙 10 mg·kg-1，空白对照组给予NS 0.2mL·kg-1。3d后再次iv OMT。7周后采用空气栓塞法处死家兔，迅速取出一侧股骨头用DEPC水冲净后置于液氮中保存，用于组织总蛋白的提取。将其中300 mg骨组织，放入提前预冷的研钵中研碎，用于总RNA提取。
1.3 组织病理学观察 10%甲醛固定一侧股骨头组织，24h后脱钙4d，常规脱水石蜡包埋行5 μm连续切片，HE染色，光镜下观察骨组织形态变化。
1.4 RT-PCR检测家兔股骨头组织中VEGF的mRNA水平
1.4.1 组织总RNA提取 采用Trizol一步法提取组织总RNA，取2 μL行1%琼脂糖凝胶电泳。
1.4.2 VEGF引物设计 利用GENEBANK获得兔VEGF165基因序列，选择其抗原性最强的部分设计兔VEGF165的基因片段(190bp)引物。Sense：5'GTG GAC ATC TTC CAG GAG TACC- 3'，Anti-sense：5'CTT TGG TCT GCA TTC ACA 3'。兔β-actin 片段(409bp)引物序列如下：Sense: 5'-TCT TCC AGC CCT TCC TG-3'，Anti-sense:5'-CGT TTC TGC GCC GTT AGGT-3'。
1.4.3 RT-PCR 取模板mRNA 10μg按试剂盒说明合成cDNA。然后取cDNA 2 μL、2× Taq PCR Mix 10μL、10pM的VEGF上下游引物各1μL和ddh3O 6μL至总体积20μL。按照下述条件行PCR反应: 95℃变性4 min，55℃退火30s，72℃延伸35s，共进行30个循环。最后一个循环结束72℃保温15 min。取10 μL PCR产物行2.0%琼脂糖凝胶电泳。凝胶分析成像后行灰度扫描分析。
1.5 Western-blot检测VEGF在家兔股骨头组织中的表达
1.5.1 组织总蛋白的提取 从液氮中取出剩余股骨头，转入装有液氮的研钵中，在保证液氮不完全挥发的前提下，将组织研磨至粉末状，收集到1.5 mL EP管中，加入2倍体积的蛋白裂解液，冰浴30 min，12000 rpm 4℃离心15 min，收集上清。
1.5.2 Western-blot 吸取10 μL上清，行12%SDS-PAGE电泳，常规转膜。丽春红染色后将膜上VEGF所在部分剪下，常规封闭。一抗为抗兔VEGF的鼠单克隆抗体(抗兔β-actin的特异性抗体作内参)。漂洗后加入羊抗鼠二抗。常规ECL荧光显色发光。应用Motic Images Advanced 3.1图像处理系统采集图像。
1.6 统计学方法 采用SPSS统计软件，应用图像分析软件分析目的条带的相对灰度值，并计算各组别/模型对照组的比值，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P&<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 病理组织切片结果 空白对照组可见骨小梁结构完整，排列规则，期间均匀分布有大量成骨细胞，无空骨陷窝，骨髓腔中含有大量的造血细胞，偶见极少量脂肪细胞;模型对照组中骨组织结构紊乱，骨小梁萎缩变窄，排列不规则，可见大量充满脂肪细胞的空骨陷窝，骨细胞核固缩，甚至消失，髓腔内造血组织明显减少，与空白对照组相比，成骨细胞数目减少，部分微血管内出现脂滴;中、高剂量氧化苦参碱组中骨小梁略稀疏，偶见个别骨组织碎片，骨髓腔内造血组织变化不大，期间可见少量小脂滴(图1，见封4)。
2.2 RT-PCR结果
在大约190bp处可见目的条带-兔VEGF165的基因片段。与空白对照组相比，模型对照组兔股骨头组织中VEGF165 mRNA的表达量极低。而OMT中、高剂量VEGF165 mRNA的表达明显上调，P&<0.05(图2)。
2.3 Western Blot结果 各组在相对分子质量为23kD处可见有VEGF165条带出现。模型对照组中VEGF的表达水平极低;氧化苦参碱中、高剂量组中VEGF的表达明显高于模型对照组，P&<0.05(图3)。
3 讨论
近年来随着激素性股骨头坏死病例的日益增多，对于需要接受短期大剂量或者长期激素治疗的患者而言，有必要寻找一种安全有效的方法在使用激素的过程中预防股骨头坏死。
氧化苦参碱是从苦豆子等豆科槐属植物中提取获得一种具有喹嗪啶类结构的生物碱，临床主要用于慢性乙型肝炎的治疗。近期，李亚娟等人提出OMT能够促进血管内皮细胞钾离子通道开放和信号物质NO的释放，发挥舒张血管、保护血管内皮和增强毛细血管通透性的作用[3]。而股骨头坏死正是由于血管生成障碍引起血供不足从而导致坏死发生。所以理论上OMT具有潜在的加强血供的作用，但其对股骨头缺血坏死是否有保护作用尚无报道。
本研究采用大剂量糖皮质激素家兔臀肌注射的方法建立股骨头缺血坏死的动物模型。通过观察OMT对股骨头组织病理学改变的影响来评价OMT对家兔激素性股骨头坏死是否有保护作用。组织学检测发现短期大剂量醋酸泼尼松臀肌注射，确实可造成家兔发生股骨头坏死。而经中、高剂量OMT预处理后，其股骨头缺血坏死的程度明显减轻，即OMT对激素性股骨头缺血坏死有保护作用。
激素导致股骨头坏死的具体机制非常复杂，很多人从激素导致脂代谢紊乱、骨内压增高到血管内凝血、血管内皮损伤等方面进行了研究[4-5]。但大家更倾向于把该病看成血管性疾病，正是由于血供不足，甚至中断，最终导致了股骨头缺血坏死的发生[6]。VEGF是目前公认的促血管形成的重要因子，在血管形成中发挥关键性作用。其家族包括5种不同的糖蛋白：VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189、VEGF206[7]。其中VEGF165的生物学活性最强。当其与受体KDR结合后能够促进微血管组织增生，并增强毛细血管后静脉和小静脉的通透性。所以VEGF是反应股骨头缺血坏死中血管因素的重要指标。本研究通过检测经过不同预处理的家兔股骨头组织中VEGF165的表达水平来探讨OMT对激素性股骨头坏死保护作用的可能机制。RT-PCR和Western blot实验结果均证实大剂量醋酸泼尼松可抑制股骨头组织中VEGF165的表达，而经中、高剂量OMT预处理可显著上调VEGF165的表达。
综上所述，我们认为给予适当剂量OMT预处理对家兔的激素性股骨头坏死有保护作用。该作用可能通过上调VEGF的表达，促进新生血管形成来实现。
参考文献
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