【摘要】 目的 研究P21 ras、CD44v6、骨桥蛋白(OPN)在肺鳞癌和腺癌中的表达及其与肺鳞癌和腺癌预后的相互关系。方法 应用免疫组化方法对96例非小细胞肺癌患者分别检测P21ras蛋白、CD44v6、OPN的表达，分析P21ras蛋白、CD44v6、OPN与肺癌组织学类型、分化程度、TNM分期等的关系，并通过34例随访病例了解以上指标与肺癌预后的关系。结果 ⑴中OPN 及CD44v6在鳞癌中表达率高于腺癌，而P21ras蛋白则在鳞癌及腺癌间表达差异无统计学意义，但P21ras蛋白、CD44v6、OPN三者共同表达在鳞癌则高于腺癌;(2)晚期肺癌P21ras蛋白、CD44v6、OPN的阳性表达率均显著高于早期患者，而CD44v6及OPN则在淋巴结已有转移者阳性表达率显著高于无淋巴结转移者;(3)P21ras蛋白、CD44v6、OPN阳性组累积生存率低于阴性组。结论 P21ras蛋白、CD44v6、OPN在鳞癌三者共同高表达，三者共同作用可能与肺鳞癌的发生、发展密切相关，P21ras蛋白、CD44v6、OPN的阳性表达预示着非小细胞肺癌不良预后。
【关键词】 RAS基因;OPN ;CD44;肺鳞癌;肺腺癌
RAS基因活化、骨桥蛋白(osteopontin，OPN)以及黏附分子CD44与肺癌的发生、发展密切相关，近年来研究报道RAS基因活化促进OPN 诱导生成[1]，而RAS基因可以增强CD44启动子活性，使 CD44表达增强，实验亦表明RAS诱导肿瘤形成通过OPN-CD44-Rac增强了细胞的侵袭性和恶性转化[2]，因此RAS基因、OPN以及CD44在肿瘤的形成、发生、发展中密切相关。本文应用免疫组化方法对P21 ras蛋白、CD44v6 及OPN进行检测，探讨它们在非小细胞肺癌中表达的相关性及其与预后的关系，进一步探索非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer ，NSCLC)发生、发展的分子生物学机制。
1 材料与方法
1.1 标本来源 选取2002年2月-2004年12月在宁夏医科大学附属医院手术切除的非小细胞肺癌患者96例，男66例，女30例，年龄32～78岁，平均57岁。鳞癌44例，腺癌52例;分化好38例，分化差58例(分化好包括中分化、中-高分化、高分化;分化差指低分化);Ⅰ期+Ⅱ期48例，Ⅲ期+Ⅳ期48例;其中有淋巴结转移77例，无淋巴结转移19例。以上标本常规福尔马林固定、石蜡包埋，且均有明确的病理诊断，所有患者术前均未接受放疗及化疗治疗。96例非小细胞肺癌患者中仅34例长期追踪随访，其余失访，其中鳞癌19例，腺癌15例，已死亡患者27例，7例仍存活。
1.2 试剂和方法 鼠抗人OPN单克隆抗体由日本株式会社提供;鼠抗人Ras-p21单克隆抗体，鼠抗人CD44v6单克隆抗体及SP免疫组化试剂盒均购自福州迈新生物技术开发公司。采用S-P免疫组化检测技术，具体操作过程严格按说明书进行。PBS代替一抗作为阴性对照，已证实的阳性肺癌组织切片作为阳性对照。
1.3 结果判断 P21ras阳性着色部位在细胞浆，阳性细胞内呈弥漫性细颗粒状，OPN亦胞浆着色。CD44v6阳性着色部位在细胞膜，阳性细胞膜呈棕黄色。
用半定量法分析免疫组化切片
A：按细胞显色深浅记分，不显色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。B：按显色细胞数记分，1/3以下为1分，1/3～2/3为2分，2/3以上为3分。积分数=A×B，A×B=0为阴性;A×B=1～4为弱阳性，低表达;A×B&>4为强阳性，高表达。
1.4 统计学方法 两样本率的处理用行×列表的χ2检验。用Kaplan-Meier 法进行生存数据的分析，Log-rank检验差异性。
2 结果
2.1 CD44v6、OPN、P21 ras蛋白与患者年龄、性别、吸烟的关系
CD44v6、OPN、P21 ras蛋白与患者的年龄、性别、吸烟与否均无关(P&>0.05)，见表1。表1 不同年龄、性别、吸烟患者CD44v6、OPN、P21 ras蛋白的表达(例数，%)
2.2 CD44v6与非小细胞肺癌的关系
非小细胞肺癌阳性表达率68.8%，鳞癌阳性表达率86.4%(38/44)，腺癌阳性表达率53.8%(28/52)，鳞癌阳性表达率显著高于腺癌。非小细胞肺癌中，早期肺癌(Ⅰ、Ⅱ期)及晚期肺癌(Ⅲ、Ⅳ期)的阳性率分别为35.4%、89.6%，两者间差别有统计学意义(P&<0.01)。非小细胞肺癌中，有淋巴结转移者CD44v6表达率(79.2%)高于无淋巴结转移者(42.1%)，P&<0.01。CD44v6与非小细胞肺癌病理分化程度无关。CD44v6在肺癌中的表达见表2、图1(见封4)。
2.3 OPN与NSCLC的关系
由图2(见封4)可见，OPN主要表达于肿瘤组织细胞，其周围的巨噬细胞和坏死组织处也有阳性表达。OPN阳性表达率非小细胞肺癌为54.2%，鳞癌为70.5%，腺癌为40.4%，鳞癌和腺癌间OPN阳性表达率差异有统计学意义(P=0.003)。非小细胞肺癌中有淋巴结转移64.9%(50/77)高于无转移者36.8%(7/19)，P=0.026。非小细胞肺癌中OPN与病理分化程度无关。早期肺癌与晚期肺癌OPN表达差异有统计学意义(P&<0.05)，详见表2。
2.4 P21ras蛋白与NSCLC的关系
表2可见，非小细胞肺癌阳性率为59.4%，其中鳞癌、腺癌的阳性表达率分别为54.5%、63.5%，鳞癌和腺癌间差异无统计学意义;非小细胞肺癌中，P21ras蛋白与肺癌病理类型、有无淋巴结转移及病理分化程度无关。非小细胞肺癌中晚期肺癌P21ras蛋白阳性表达率高于早期肺癌。P21ras蛋白在肺癌中的表达见图3(封4)。表2 CD44v6、P21 ras、OPN与NSCLC临床病理特征的关系(%)与鳞癌比较*P&<0.05;与无淋巴结转移比较△P&<0.05;与Ⅰ-Ⅱ期比较▲P&<0.05，▲▲P&<0.01
2.5 P21ras蛋白、CD44v6和OPN与非小细胞肺癌预后的关系
P21ras蛋白、CD44v6和OPN阳性组累积生存率低于阴性表达组，同时P21ras蛋白、CD44v6和OPN阳性组中位生存期较阴性组短，经Log-rank检验差异有统计学意义。鳞癌的中位生存期32个月，腺癌中位生存期20个月，鳞癌累积生存率较腺癌长(见表3)。表3 P21ras蛋白、CD44v6和OPN的表达44例鳞癌患者中P21 ras、OPN、CD44v6三者均表达者为18例(42.9%)，而52例腺癌中P21 ras 、OPN、CD44v6三者均表达着为8例(15.4%)，二者相比差异有统计学意义(P&<0.01)。故P21 ras、OPN、CD44v6三者共同表达主要是在NSCLC鳞癌中，而非腺癌。
3 讨论
RAS基因是人类最常见的癌基因之一，在信号转导及细胞增殖方面起主导作用。RAS基因家族由N-ras、K-ras、H-ras组成，在肿瘤中的改变以点突变为主;在非小细胞肺癌中以K-ras基因单碱基突变为主。因突变RAS基因的编码蛋白存在单个氨基酸的改变，若发现突变RAS基因的编码蛋白P21-ras蛋白有高表达，可推测相应部位可能存在突变的RAS基因。
本研究结果显示非小细胞肺癌P21 ras蛋白阳性率为59.4%，其中鳞癌、腺癌的阳性表达率分别为54.5%、63.5%，两者间无统计学意义。非小细胞肺癌中，晚期肺癌P21 ras蛋白阳性率高于早期肺癌。P21 ras蛋白阳性组累积生存率低于表达阴性组。有人筛选了8篇检测K-ras基因突变同时有2年生存资料的非小细胞肺癌的文献，用META分析综合了881例非小细胞肺癌K-ras基因突变与2年生存率的关系，结果提示突变者生存期明显缩短[3]。因此非小细胞肺癌RAS基因突变预示不良预后。
OPN是一种具有多种生物学功能的分泌性、糖基化的磷酸蛋白，研究证实已发生转化的细胞株可分泌OPN，而多数肿瘤组织(胃癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌等)OPN呈高表达，71%肺癌组织OPN阳性表达[4]，本研究提示非小细胞肺癌中，鳞癌的阳性表达率显著高于腺癌，张锦等[5]研究提示OPN在鳞癌呈优势表达。实验中发现非小细胞肺癌中有淋巴结转移者OPN阳性表达率高于无转移者，且早期肺癌低于晚期肺癌的OPN表达，与Chang等[6]研究结果一致;而Hu等[7]检测了318例肺癌组织及143例肺癌患者血浆，结果表明肺癌组织及血浆OPN高表达，且OPN表达与肿瘤分期及淋巴结转移密切相关，以上结果均提示OPN可能参与了肺癌的浸润和转移。本研究结果显示OPN阳性组累积生存率低于表达阴性组。Boldrini等人[8]研究也证实OPN高表达预示着肺癌的不良预后。由此可见，OPN与非小细胞肺癌的发生、发展及转移密切相关，OPN表达预测非小细胞肺癌不良的预后。
宁夏医科大学学报32卷
CD44是细胞表面的跨膜糖蛋白，是介导细胞与细胞、细胞与基质间相互作用的黏附分子，其功能是CD44在细胞外基质与透明质酸结合，维持组织或器官的结构，促进细胞浸润和介导细胞迁移。CD44v6是CD44的一种拼接变异体，CD44v6的表达可能改变肿瘤的构成和功能，有助于肿瘤细胞获得转移潜能。近年来研究发现CD44v6的异常表达与许多人类恶性肿瘤的发生、发展和侵袭转移及预后密切相关。
本研究结果显示非小细胞肺癌中CD44v6在鳞癌的阳性表达率显著高于腺癌。已有文献报道[9-10]CD44v6在肺癌组织阳性表达率显著高于正常组织且鳞癌高于腺癌，且已有转移的淋巴结CD44v6呈高表达，提示CD44v6参与肺鳞癌淋巴结的转移。本研究结果也提示有淋巴结转移者CD44v6阳性表达率高于无淋巴结转移者，且晚期肺癌的CD44v6表达率高于早期肺癌。CD44v6阳性组累积生存率低于表达阴性组。Migoshi等[11]人研究也表明有淋巴结转移者CD44v6阳性表达率显著高于无淋巴结转移者，而 Hirata等[12]人报道CD44v6阳性组5年生存率低于表达阴性组， 阳性组远处转移率明显高于阴性组，提示CD44v6表达预示了I期非小细胞肺癌的预后不佳。
较多研究已证实RAS癌基因参与OPN诱导生成[1]，RAS是通过作用于OPN的启动子RAE序列诱导OPN表达，这可能是由于OPN的启动子上含有RAS的调控元件。本研究结果提示OPN在鳞癌中表达高于腺癌， OPN与P21ras蛋白在鳞癌的共同表达率高于腺癌，推测肺癌中RAS的活化可能与肺鳞癌OPN的高表达有关， 肺鳞癌中OPN受RAS的调控并参与了肿瘤的发展，而在腺癌中无此种情况，这与张锦的研究结果相似[5]。
4期张 锦，等.P21 ras、骨桥蛋白及CD44v6与肺鳞癌和腺癌关系的研究
Hofmann等[13]用激活的RAS基因转染克隆鼠胚胎成纤维细胞可使其表达CD44，并具有转移特性，用腺病毒基因EIA可以抑制CD44表达及转移特性，并证明激活的ras基因可以增强CD44启动子活性，从而使CD44表达增加。OPN通过RGD-依赖或RGD-非依赖的方式与黏附分子整合素家族(主要为αvβ3、αvβ5和αvβ1)以及分子相互作用，诱导细胞的增殖、迁移和侵袭，可能以这种方式参与肿瘤的演进和转移过程[14]。本研究结果也提示CD44v6、OPN均与非小细胞肺癌的临床分期有关，这与喻鈞等[15]研究结果相符。一些研究表明OPN可以特异的与CD44v6和或 CD44v7相互作用，能调节促进细胞存活、趋化及黏附通路，增加肿瘤细胞的转移能力[16]。CD44同OPN的共同表达与胃癌和肝癌的进展与转移密切相关。
近年来人们发现RAS基因、OPN 以及CD44v6相互联系在肿瘤的发生、发展和转移中发挥着重要作用。Teramoto等[17]研究中发现，不论CD44抗体阻断其表达还是以OPN反义RNA抑制OPN的表达均能抑制肿瘤细胞的侵袭性和恶性转化，在NIH 3T3细胞RAS诱导肿瘤形成通过OPN-CD44-Rac增强了细胞的侵袭性和恶性转化，因此RAS基因、OPN以及CD44在肿瘤的形成发生发展中密切相关。Teramoto的研究在体外肿瘤细胞株中证实，然而三者在非小细胞肺癌中体内的关系仍鲜有报道。本研究结果提示非小细胞肺癌中CD44v6、OPN及P21ras蛋白三者的共同表达在鳞癌高于腺癌，鳞癌的中位生存期较腺癌长。由此推断鳞癌中在OPN的参与下RAS基因突变促进了肺癌的发生，而在细胞因子CD44v6和OPN协调下肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭明显增强，P21 ras、OPN、CD44v6 共同作用可能与肺鳞癌的发生、发展密切相关。
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