作者：崔岫 于佳 孙静 贺小亮 杨旭
【摘要】 目的 观察第Ⅷ因子相关抗原(FⅧ-RAg)和CD34对卵巢移植物新生血管标记的敏感性，为移植物血管生成的观察提供有用的技术方法。方法 采用CD34和FⅧ-RAg免疫组化法对移植卵巢和移植部位进行染色，镜下观察其显示新生内皮细胞的特异性和着色强度。结果 CD34阳性细胞主要位于移植物内，细胞较大。FⅧ-RAg 阳性细胞存在于肾脏和移植物内，多为成熟的长梭型内皮细胞，且阳性细胞总数明显多于CD34。结论 CD34适用于显示移植卵巢的新生血管内皮细胞。
【关键词】 免疫组化，新生血管 FⅧ-RAg; CD34;卵巢移植;小鼠
有研究报道，非血管吻合卵巢组织移植后，约60%的卵泡因缺血缺氧而丢失[1]，这种结果将影响卵巢大皮质块移植后的成活，从而导致通过增大移植卵巢体积而延长移植卵巢功能寿命的目标难以实现。目前，研究者们正在寻求促进移植卵巢与移植部位血管贯通的刺激因子。移植后血管的新生参与了受体与移植物内血流的贯通，因此血管新生过程中内皮细胞移植卵巢的增殖成为判断刺激因子是否有效的重要指标。第八因子相关抗原(factor Ⅷ related antigen， FⅧ-RAg)和CD34是内皮细胞的特异性表面标记，但究竟哪一个更适合于显示新生内皮，在卵巢移植的血管贯通方面还鲜见报道。为给研究刺激因子是否引起内皮细胞的增生提供有效的检测方法，我们应用免疫组织化学方法，比较CD34和FⅧ-RAg在显示新生血管方面的灵敏性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 ICR品系雌性小白鼠，体重(20±2)g。
1.1.2 主要试剂 一抗为鼠抗CD34单克隆抗体，(Thermo生物工程有限公司产品)，FⅧ-RAg为多克隆一抗(北京博奥森生物工程有限公司产品)，二抗为山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG工作液 (基因科技上海有限公司产品)。
1.2 标本取材
移植卵巢：ICR品系雌性小白鼠麻醉下切除双侧卵巢，纵向切成两半，在DMEM+F12 的培养液中体外培养3 h后，行肾脏被膜下半卵巢移植，36 h后颈椎脱臼处死小鼠。观察半卵巢数目为6枚。此期是血管生成时期。为了确定操作方法的准确性，我们采用乳腺癌标本作为阳性标本。乳腺癌标本来自宁夏医科大学附属医院病理科。
1.3 CD34及FVIII免疫组化方法
CD34使用稀释度为1∶400，FⅧ-RAg使用稀释度为1∶200，采用免疫组化Envision法，阴性对照以PBS 代替一抗，人乳腺癌组织切片做阳性对照。操作步骤严格按试剂盒操作说明书进行。
1.4 免疫组化结果判定 以内皮细胞胞浆呈棕黑色为强阳性，棕黄色为中等阳性，以淡黄色为弱阳性，每个卵巢观察3张切片，每张切片计数5个高倍视野，观察分析每高倍视野的阳性细胞数。
1.5 统计学方法 采用SPSS 11.5统计学软件进行t检验。
2 结果
墨汁灌注法表明，卵巢移植36h时肾与移植卵巢组织间的血流已贯通。由于乳腺癌组织的新生血管较多，因此作为观察新生血管的阳性对照片。免疫组化染色发现，该组织中血管内皮细胞CD34在细胞胞质及细胞核均显示阳性(图1，见封2)，而FⅧ-RAg着色特异性较差，非特异扩散较明显。观察卵巢移植部位发现，CD34分布于内皮细胞的胞质和细胞核，阳性细胞较大、轮廓清晰，且阳性细胞主要发布在肾脏-卵巢交界处及卵巢组织内的组织中(图2，见封2)，而交界以外的肾脏内血管几乎无阳性表达。FⅧ-RAg免疫组织化学结果显示，在肾脏-卵巢交界处及卵巢组织内、卵母细胞胞质、肾小管上皮细胞胞质均有FⅧ-RAg阳性细胞(图3，见封2)。阳性细胞多为成熟的长梭型内皮细胞，细胞较小、轮廓不清晰。对两种染色结果进行阳性细胞计数，结果表明，CD34的阳性细胞数明显低于FⅧ-RAg，结果见表1。表1 CD34及FⅧ-RAg免疫组织化学阳性细胞数结果比较(±s)
3 讨论
移植卵巢血管生成与人类的生殖活动密切相关，包括卵泡发育、黄体形成等，对于移植卵巢来讲，血管的生成是移植物存活不可或缺的环节，它不仅为组织细胞提供血供，而且也是其分泌激素进入血流到达靶器官的重要途径。而新生成血管内皮细胞染色可以清楚地显示各种血管生成影响因子的作用强度。常用于显示血管内皮细胞的表面标记有 CD31、CD34、CD105、FⅧ-RAg 等。FⅧ- RAg是一种广泛存在于血管内皮细胞表面的糖蛋白，可与第Ⅷ因子大亚基上的相关抗原结合，是血管最常用、最特异的内皮细胞标记物。CD34的主要功能是在细胞间起到黏附作用，是显示血管内皮细胞间黏附作用的最佳指标，被认为是重复性较好的血管内皮细胞标记物。CD34在正常及肿瘤性的小血管内皮中都有表达，是一种与新生小血管相关的抗原，其在血管内皮中的作用机制尚不清楚，但由于其在新生血管内皮中表达远大于非新生血管内皮，提示其作用可能与血管生成时细胞间相互识别和黏附有关。同时，CD34作为最敏感的血管内皮标记物，为人们提供了鉴别血管源性肿瘤和某些实体肿瘤的新方法[2]。为准确反映移植部位与移植物间血管生成的真实情况，本研究采用了FⅧ-RAg和CD34单克隆抗体标记血管。
肿瘤的侵袭和转移过程中，血管的生成是一个不可或缺的环节，它不仅为肿瘤细胞提供血供，而且也是其转移的重要途径。而生成血管的血管内皮细胞染色可以清楚地显示肿瘤的血管密度，反映肿瘤的生物学特性[3]。因此我们以乳腺癌组织作为阳性对照，以检测CD34和FⅧ-RAg在显示新生血管方面的灵敏性。染色结果表明CD34较FⅧ-RAg清晰。从对移植部位的免疫组织化学染色结果来看，CD34的阳性细胞数明显低于FⅧ-RAg，阳性细胞较大，位于肾脏与抑制卵巢交界处及移植卵巢卵泡膜及间质，而肾小球毛细血管球CD34免疫组化结果阴性，说明CD34不表达于非新生血管内皮。与FⅧ-RAg相比，CD34更能突出显示较小的、不成熟的微血管或单个新增值的内皮细胞。而在FⅧ-RAg染色中呈强阳性的细胞是成熟的内皮细胞，细胞显示长杆状。同时，所有切片中的大部分肾脏组织细胞和卵巢组织细胞着色，反应了FⅧ-RAg对内皮细胞的显示缺乏新增生的与成熟的之分，且可能与内皮以外的某些抗原也可以结合，这可能与FⅧ-RAg抗体缺乏特异性有关[4]。而CD34无明显其它细胞染色现象，阳性结果清晰。因此，我们认为， FⅧ-RAg不适宜于新生血管的检测，而CD34是本研究中较好的血管内皮标记物。
参考文献
[1] Aubard Y， Piver P， Cogni Y， et al. Orthotopic and heterotopic autographts of frozen-thawed ovarian cortex in sheep [J]. Human Reprod，1999，14:2149-2151.
[2] 柏树令，赵丹.CD34抗原的生物学特性及其临床应用[J].解剖科学进展，2005，11(1)：54-56.
[3] 汪国文，王祖义，刘学刚，等.CD31与CD34显示非小细胞肺癌微血管密度的对比分析[J].蚌埠医学院学报，2009，34(31):85-87.
[4] 张景峰.各种影像学技术在评价肿瘤血管生成方面的研究现状与新进展[J].国外医学：临床放射学分册，2007，83(6):361-365.