作者：徐静， 穆静， 徐武清， 刘雅妮， 王文平
【摘要】 目的 探讨不同浓度枸杞叶（LBL）含药血清对长波紫外线（UVA）辐射致人真皮成纤维细胞（HSF）损伤的防护作用及其作用机制。方法 采用强度2.8J·cm-2的UVA照射HSF损伤造模，实验分为空白组、对照组、UVA模型组、空白血清组、UVA +0.15g·mL-1 LBL组，UVA +1.5 g·mL-1 LBL 组和VitC阳性对照组，用MTT法检测细胞增殖活性，酶生化法检测MDA 含量及培养液中LDH漏出量。 结果 正常大鼠血清不影响HSF功能，UVA照射HSF损伤法可造成HSF增殖活性降低，MDA 含量升高，LDH漏出增加，与空白组相比差异有统计学意义(P均＜0.05)；不同浓度的LBL及VitC均能增加细胞的增殖活性，减少MDA含量和LDH的漏出量，但LBL作用更优(P＜ 0.05)。结论 不同浓度LBL对UVA损伤的HSF均有一定的保护作用，其机制可能与LBL的抗氧化作用及促进细胞增殖活性有关。
【关键词】 枸杞叶；长波紫外线；人皮肤成纤维细胞；抗氧化；细胞增殖
Abstract: Objective To explore the protective effects and mechanism of the different concentrations of lycium barbarum leaf (LBL) containing serum on human skin fibroblast(HSF) in vitro irradiated by ultraviolet A (UVA). Methods HSF model was established using the irradiation intensity 2.8J·cm-2 of UVA damage. Experiment were pided into blank group and control group， UVA radiated group， blank serum group， two different concentrations of LBL protective group and the VitC-positive control group. The activities of cell proliferation were measured by MTT methods. The contents of MDA and the activities of LDH in the supernatants of fibroblasts were determined by biochemical methods. Results Normal rat serum did not affect the function of HSF. That the fibroblasts were irradiated by UVA caused the decrease in the activities of cell proliferation and increase in the content of MDA and LDH(Compared with the blank group both P＜0.05). Different concentrations of LBL and the VitC could increase the activities of cell proliferation and reduce the content of MDA and LDH， but the role of better LBL. Conclusions Different concentrations of LBL have protective effects on fibroblast irradiated by UVA. The mechanism of this effect may be associated with it's anti-oxidative effect and enhancing cell's proliferation.
Key words:Lycium barbarum leaf; ultraviolet A; Human skin fibroblast; antioxidant; cell proliferation
宁夏枸杞在《回回药方》中称之为忽咱则。枸杞叶（Lycium barbarum leaf，LBL）是茄科植物枸杞的树叶，其药用价值历代文献均有记载。甄权在《药性本草》中说：“用枸杞叶作饮代茶，能止渴、清烦热、益阳事。” 唐刘禹锡《传信方》以枸杞叶煮粥，治疗劳损，《本草纲目》称枸杞叶有“除烦益志，补五劳七伤，壮心气，除热毒，散疮肿，除风明目”之功效。本研究采用体外培养人真皮成纤维细胞（uman skin fibroblast，HSF）建立长波紫外线（ultraviolet A，UVA）损伤模型，观察LBL对细胞损伤的保护作用。
1 研究方法
1.1 LBL含药血清制备
1.1.1 LBL水提药液制备
实验所用枸杞叶140g，全部一次性购于宁夏银川市国大药房（来源于宁夏中宁地区）。将LBL置于砂锅内，加相当于药材量10倍的纯净凉水浸泡1～2min，煮沸30min，滤过；药渣加3～6倍量水继续煎煮，煮沸15～20min，滤过。合并2次煎出液，于水浴上浓缩至每1mL 相当于药材量1～2g的药液。
1.1.2 含药血清制备
选用雄性SD大鼠20只（由宁夏医科大学实验动物中心提供），体重300g左右，常规饲养1周后，随机分为4组：LBL高剂量组、LBL低剂量组、维生素Ｃ（VitC）对照组和空白对照组，每组5只。LBL高剂量组灌入1.5g·mL-1高浓度LBL水提药液，LBL低剂量组灌入0.15g·mL-1低浓度LBL水提药液，VitC对照组灌入0.1%VitC溶液，空白对照组灌入0.9% 生理盐水。4组大鼠每次灌胃药量均为1mL·100g-1体重，每日2次，连续灌胃3d。第3天末次给药1h后，按照通法采血， 3000r·min-1，10～15min，分离血清，55℃，30min灭活后，按不同组别大鼠制成4种血清。其中LBL高、低剂量组， VitC对照组大鼠血清统称含药血清，生理盐水空白对照组大鼠血清称为空白血清。最后用各组含药血清和空白血清分别配置含20%血清的DMEM完全培养液（加双抗），分装置低温冰箱备用。
1.2 UVA照射法致HSF损伤模型
1.2.1 细胞培养及分组处理
取自无菌状态下“包皮环切术”所切除的正常皮肤，要求供皮者为健康成年男性。将所取皮肤置于75%的乙醇中漂洗数次，迅速浸入含有低浓度双抗的PBS中30min以上，剪成0.2 cm×0.5cm大小，置于培养皿中，加入0.25%的胰酶消化过夜，次日分离表、真皮，放入37℃，5%CO2培养箱（Revco公司）中孵育。用DMEM完全培养液（含20%胎牛血清、100μ·mL-1青霉素钠、100μg·mL-1链霉素）常规培养，建立二倍体细胞系，取3～6代对数生长期细胞，随机分为7组：空白组（不经UVA 辐照，不加任何大鼠血清），对照组（不经UVA 辐照，加入空白血清），UVA 模型组（UVA辐照， 不加任何大鼠血清），UVA +0.15g·mL-1 LBL组，UVA +1.5 g·mL-1 LBL 组，UVA + VitC组，UVA +空白血清组。处理方法：各UVA辐照组细胞均于造模前3h分别用相应大鼠的含药血清和空白血清培养液换液后（UVA 模型组不加任何大鼠血清），按本文后叙UVA辐照方法进行造模；空白组和对照组均不进行造模处理。
1.2.2 UVA辐照HSF损伤模型
造模方法参照文献［1］进行，各组细胞造模前，先用PBS洗3遍，用UVA紫外灯（美国SP公司生产）照射， UVA紫外光源距离细胞15cm，辐射强度为2mW·cm-2，照射时间为1400s，用UVA型紫外辐照计（北京师范大学光电仪器厂生产，波长范围320～400nm，波峰365nm）进行检测，照射总剂量为2.8J·cm-2。照射后再用PBS洗1遍，各组细胞分别加入相应的培养液继续孵育24h后检测各项指标。
1.3 检测指标
1.3.1 MTT法测定细胞增殖活力
取3～6代对数生长期细胞，调节细胞密度为5×104cell·mL-1，接种于96孔板上，每孔100μL，随机分为7组（分组方法同上），每组设8个复孔。培养24h 后，各组细胞按前述分组处理方法及造模方法分别处理，照射后各孔重新加入原来的培养液，再加入5mg·mL-1 的MTT 20μL，继续培养4h，弃去上清液，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150μL，37℃下振荡15min ，用酶标仪在490nm 波长处测定各孔的吸光度（OD）值。
1.3.2 丙二醛（MDA）测定
细胞按上述方法处理完毕后，继续培养4h，离心收集细胞，用冷PBS清洗2次，超声破碎细胞，严格按照试剂盒说明书检测MDA含量。
1.3.3 乳酸脱氢酶（LDH）测定
细胞按上述方法处理完毕后，继续培养18h ，取上清液，严格按照试剂盒说明书检测其中LDH含量。
1.4 统计学方法
用SPSS 13.0软件对结果进行统计分析，各组数据以（±s）表示，多样本均数间比较采用One-Way ANOVA检验，组间的两两比较采用SNK检验，显著性检验水平为0.05。
2 结果
2.1 LBL对UVA照射致HSF增殖活性改变的影响
见表1。表1 MTT法检测HSF增殖活性测定结果（略）
UVA+各含药血清组的OD值与UVA+空白血清组相比均有升高（P＜0.05），说明LBL和VitC都能够增加HSF的增殖活性。另外不同浓度LBL组OD值与VitC组相比均升高（P＜0.05），说明LBL对增加HSF的增殖活性优于VitC；而两个LBL间差异无统计学意义（P＞0.05），提示LBL对HSF增殖活性作用并没用随浓度增加而增强。
2.2 LBL对UVA照射致HSFMDA含量和LDH漏出量的影响
见表2。表2 MDA含量和LDH漏出量检测结果（略）
UVA+各含药血清组与UVA+空白血清组相比，MDA含量和LDH漏出量均降低（P＜0.01），说明LBL和VitC都具有减轻UVA所致的脂质过氧化损伤，降低损伤程度的作用。与VitC组相比，不同浓度LBL组MDA含量和LDH漏出量均降低，说明LBL对HSF的保护作用优于VitC；而不同浓度LBL间差异无统计学意义（P＞0.05），说明LBL对HSF的保护作用没有随浓度增加而增强。
3 讨论人体皮肤反复接受日光紫外线的照射后会引起皮肤光老化，出现皮肤松弛粗糙、色素沉积、弹性下降、皱纹增多等光老化外观。紫外线所致皮肤出现的光老化等损伤属于传统中医之热毒蕴郁肌肤，不得外泄，熏蒸为患，而肺在体合皮、其华在毛，故以清热解毒、宣肺为主要治则。目前已有大量的实验证实许多中药具有较强的抗氧化及抗光老化作用，如银杏叶、大黄、灵芝、枸杞［2］、西洋参、五味子等。而中药LBL轻清宣散，具有清热、祛风明目，补虚益精等功效。《洞天保生录》有以杞叶煎汤沐浴，使肌肤光泽，疾病不生的记载。一些学者通过定量分析发现，枸杞叶中的5种黄酮类化合物具有较强的抗氧化活性，是优良的天然抗氧化剂［3］，宁夏枸杞叶无论在活性成分，营养成分还是微量元素方面，与枸杞果实基本一致，在量上某些成分甚至超过果实［4］，而且当代药理实验研究发现，枸杞叶具有抗诱变及防癌抗癌作用，LBL代茶常饮，能显著提高和改善人体的免疫功能和生理功能，具有强壮肌体和延缓衰老的作用［5］。本研究结果提示LBL对紫外光损伤的HSF具有保护作用，进一步证明了这一理论。
HSF是真皮主要细胞，HSF的光老化是造成皮肤光老化的重要原因。有研究表明紫外辐射是一种重要的氧化应激源，经常被用来诱导氧化损伤［6］ 紫外线，主要通过直接作用、激活某些光敏分子、脂质过氧化反应的途径损伤机体细胞［7］ 。
UVA可直接损伤体外培养的HSF，引起HSF形态发生皱缩，贴附功能下降，悬浮增加。本研究模拟紫外线损伤皮肤，对原代培养HSF进行UVA辐照法损伤造模，结果表明：①UVA确实能够损伤HSF；②正常大鼠血清不会对HSF造成损伤，HSF损伤模型成功完全是UVA对HSF损伤所致，与加入的大鼠血清等其它影响因素无关，因此可确保本研究中干预因素检测结果的可信度和科学性；③不同浓度LBL药液及VitC对UVA损伤的HSF均有一定的保护作用，且LBL的保护作用明显优于VitC；④实验中发现LBL低剂量组和高剂量组之间差异无统计学意义，这可能与本实验中所设置的低剂量为临床常用量，而高剂量为低剂量的10倍有关。但这也说明临床常用剂量即可起到保护作用，加大剂量不但不能提高治疗作用，还可能起到相反作用。因此认为，LBL能够减轻UVA对HSF的光损伤，其机制可能与LBL促进细胞增殖活性作用有关。
紫外线直接作用于HSF，产生氧自由基攻击生物膜上的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化，形成脂质过氧化产物，进而引起细胞损伤。MDA含量可反映机体内脂质过氧化的程度和细胞损伤程度，能间接地反映出细胞损伤的程度。LDH是机体能量代谢中的一种重要酶，LDH质与量的改变，直接影响到机体的能量代谢，当细胞受到外来刺激或致伤因素后，可大量释放或漏出LDH到细胞外，提示细胞膜受损，其量的多少与细胞膜的受损程度呈正相关，是一个反映细胞膜损伤的良好指标之一［8］ ， MDA含量和LDH漏出量可从不同角度说明HSF的损伤程度。本研究表明，不同浓度LBL药液及VitC对UVA损伤的HSF均不同程度的降低MDA含量和LDH漏出量，且LBL的作用明显优于VitC，说明LBL对UVA损伤HSF的抗氧化能力及对HSF细胞膜的保护作用均好于VitC。但不同浓度LBL的作用无差异，原因同前，不再赘述。
UVA作为太阳辐射重要组分对皮肤HSF可造成一定的损伤，可引起脂质过氧化，降低细胞增殖活性，损伤细胞膜。为减轻UVA 对皮肤的损伤，应用抗氧化剂已成为人们防护皮肤的有效选择［9-10］。LBL在宁夏地区有着丰富的资源优势，作为天然植物进行进一步开发研究有很大的应用前景。通过本项研究，证实了LBL确有抗紫外线损伤的作用，这对今后研制防护紫外线的LBL产品具有一定的参考价值。
参考文献
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