作者：吴莉，沈江涌，杨美玲，杨桂珍
【摘要】 目的局部应用血管内皮生长因子基因转染大鼠皮瓣，初步探讨其对皮瓣成活率的影响及对皮瓣不同部分促血管作用效果。方法将30只SD大鼠作为实验模型，随机分为3组，每组10只，制作背部随意皮瓣，分别注入脂质体包裹的PcDNAVEGF165(目的基因组，实验组)，PcDNA(空白质粒组，对照组)， NS(生理盐水组，对照组) 。术后4d断蒂，断蒂后7d处死大鼠观察：(1)各组皮瓣成活率比较。(2)取皮瓣远端活组织标本行常规HE染色，检测平均微血管数目及内径。(3)取皮瓣远端活组织标本行VEGF 免疫组化染色观察VEGF表达情况。(4)取目的基因组皮瓣远段，中段，近段成活组织标本常规HE染色，检测平均微皮瓣血管数目。结果目的基因组皮瓣平均成活率明显高于空白质粒组和生理盐水组两对照组，平均微血管数目明显多于两对照组，且为管径较小的新生血管，均具有统计学意义(P&<0.05)。免疫组化染色强度高于两对照组。目的基因组皮瓣远端血管数目多于近端，具有统计学意义(P&<0.05)。结论局部注射VEGF基因后可以增加缺血皮瓣血管新生，提高皮瓣成活率，在皮瓣不同部位促血管增生作用不同。
【关键词】 血管内皮生长因子;大鼠;皮瓣
研究表明PTEN可以增加MMP-2抑制物TIMP-2的分泌[8]，TIMP-2可与MMP-2以1∶1形式形成复合物，抑制了MMP-2的活性。许雪峰[9]等研究MMP-2、PTEN的表达情况，发现联合检测两者可作为判断贲门癌侵袭转移能力的客观指标。在本组资料中二者在食管鳞癌中表达呈负相关(P&<0.05)， 随着食管癌的进展，食管癌组织中MMP-2和表达升高，而PTEN则表达降低，推测PTEN基因可能通过影响MMP-2的表达而影响肿瘤细胞浸润转移，影响患者预后但具体的调控机制有待于进一步研究。
[Abstract]ObjectiveTo explore the topical application of vascular endothelial growth factor gene to rat's skin and its effects on flap survival and flap vascular of the different parts，right flap vascular role of the different parts.Methods30 rats were pided into three groups (n=10). After the model of flap was established in the rats，PcDNAVEGF165 was injected in purpose gene group;PcDNA was injected in bland plasmid group and NS was injected in control group. After flap formed and drug used，the pedicel was devised at 4 days. 7 days after pedicle pision，the rats were killed，and then the flap survival rate was measured. The microvessels were study by histological examination. The expression of VEGF was assessed by imunohistochemical staining.ResultsThe average flap survival rate of the target gene group was significantly higher than the blank plasmid group and saline group and control group. The average number of blood vessels significantly more than two control groups. And smaller in diameter and angiogenesis (P&<0.05). Immunohistochemical staining was higher than that in two control groups.ConclusionAfter local injection of VEGF gene can increase the angiogenesis of ischemic skin flap to improve flap survival rate，different parts of the flap to promote the role of different angiogenesis.
[Key words]Vascular endothelial growth factor; Rats; Flap
目前应用血管内皮生长因子基因转染皮瓣成为该领域研究热点之一。本实验将人VEGFcDNA以脂质体为载体，皮下注射于大鼠皮瓣，探讨其对增加皮瓣成活的影响，及基因在皮瓣不同部位发挥作用情况，为将其进一步应用临床进行探索。
1材料与方法
1.1重组质粒的准备:
PcDNAVEGF165(华中科技大学同济医学院杨操博士提供)含有VEGF165基因片段，位于BamHI和EcoRI两个酶切位点之间。将PcDNAVEGF165转化大肠杆菌HB101感受态细胞，挑选抗氨卞青霉素克隆进行小量快速提取，用BamHI和EcoRI双酶切鉴定，同时送北京华大生物有限公司进行双向测序鉴定是否为所要目的基因。将保存的大肠杆菌菌种通过碱裂解法大量提取质粒，聚已二醇8000纯化。制备的质粒经核酸，蛋白微量仪测定(美国BIO-RAD公司)定量为12.5μg/μl，以生理盐水稀释为浓度1μg/μl备用。
1. 2脂质体的制备与基因包裹：
用电子分析天平称取磷脂酰胆碱(PC，sigma 公司)20mg，胆固醇(Chol，sigma 公司)10mg倒入旋转烧瓶中。用量筒取氯仿60ml，甲醇20ml，倒入高压灭菌球形旋转烧瓶中溶解磷脂酰胆碱、胆固醇。将旋转烧瓶温度调整在70℃左右，转速为45次/min。待溶液完全蒸干，形成白色光滑膜附着于烧瓶壁，温度冷却后加入5ml乙醚，加入40ml含有PCD-VEGF165缓冲液(用生理盐水稀释原液至1ml含100μg PCD-VEGF165的缓冲液)。在70℃低转速10转/min洗膜，蒸6min后乙醚基本除尽。将超声探头放入液体中，通电5min形成均匀乳白色液，静置2h不分相。将液体分装1.0ml(质粒100μg)在1.5ml高压灭菌的Eppendorf管中备用。
1.3动物分组与皮瓣设计:
将30只雄性SD大鼠，体重(350±50g)随机分成3组：实验组为目的基因组，两对照组分别为空白质粒组，生理盐水组，每组10 只。用6.5%水合氯醛(0.05ml/kg)腹腔注射麻醉后，俯卧位固定，背部10%硫化钠脱毛，清水清洗，0.5%碘伏消毒，铺单。所有实验动物在背部以脊柱为中心轴线，设计3cm×9cm的随意皮瓣，蒂位于髂脊水平。皮瓣在背部肌膜浅面掀起，术中将皮瓣掀起翻转180度，在皮瓣区域内选取均匀分布的10个点，由筋膜面向皮下用微量注射器分别注入含有VEGF基因的重组质粒500μg(每点50μg)，空白质粒500μg，生理盐水组500μl(每点50μl)。术后3-0丝线原位缝合，单笼喂养。所有动物均在术后第4天同法麻醉，断蒂，必须切断蒂部血供，间断缝合。
1.4检测指标:①皮瓣成活率
：断蒂后第7d，皮瓣成活与坏死界限明确，将大鼠注射过量麻药无痛处死，数码相机拍照，透明硫酸纸精确描绘皮瓣成活及坏死区域，称量纸复录，电子分析天平称重，以重量比表示面积比，计算皮瓣成活率(皮瓣成活率=皮瓣成活面积/皮瓣成活面积+皮瓣坏死面积)×100%。②平均微血管数目及内径：取皮瓣组织(正常与坏死交界0.5cm处正常组织即皮瓣远段)。HE染色，在10×40高倍镜下随机选取5个视野，通过医学图文数字系统软件计数微血管数目，所计数血管中必须有红细胞，并同时测量管径大小，各组计算平均数。目的基因组同时取距断蒂处5cm(皮瓣中段)，2cm(皮瓣近段)处皮瓣组织，HE染色，计数皮瓣不同部分微血管数目。③VEGF免疫组化：取皮瓣远段和近段成活组织行免疫组化染色(按北京博奥森生物技术有限公司说明书操作)，观察基因转染情况。
1.5统计学方法:
所得数据均用(±s)表示，利用SPSS13.0软件进行处理，按照方差分析中多个样本均数间的多重比较，使用SNK-q检验(样本均数两两比较)。
2结果
2.1测序结果:
提取的目的基因测序证实为所要研究的VEGF165基因片段，见图1(封二)。
2.2皮瓣平均成活率及微血管数目与内径检测
：目的基因组皮瓣平均成活率[(84.35±5.36%)]显著高于空白质粒组1的[(56.27±3.85%)]和生理盐水组2的[(55.81±5.20%)](t1=20.617，t2=21.615，P&<0.05);平均微血管数目多于对照组(t1=15.774，t2=15.513，P&<0.05);平均微血管内径小于两对照组(t1=21.068，t2=39.582，P&<0.05)。见图2-3(封二)。
2.3目的基因组皮瓣远段新生血管数目明显较近中段增多：
见表1。表1目的基因组皮瓣不同处微血管数
2.4免疫组化检测皮瓣VEGF结果：
实验组VEGF着色较对照组深，见图4-5(封二)。
3讨论
当严重创伤导致神经、血管、肌腱、骨组织等重要结构外露，或者在功能和美容上对修复重建有较高要求时，通常需要皮瓣修复，但皮瓣远端部分坏死及带蒂皮瓣因血管化慢致断蒂时间长是其不足。目前带蒂皮瓣断蒂时间的选择，临床尚无统一标准，大多选择3周左右，所以需患者较长时间处于不适体位，易造成多项并发症及意外发生。血管内皮细胞生长因子(VEGF)是迄今发现作用最强的血管形因子。有研究表明，应用其重组蛋白能够提高皮瓣成活、促进组织愈合 [1-2]。但受其半衰期短、费用高、需多次用药、有可能用重组蛋白有不良反应等不能广泛应用。随着基因治疗技术的迅猛发展，通过转基因技术提高血管内皮生长因子的表达，可克服其直接应用缺点。 自1998年Taub[3]等人首次研究证明，血管内注射VEGF基因能够促进血管增生，提高大鼠皮瓣成活以来，国内外学者有关VEGF基因转染提高皮瓣成活率，促进早期断蒂的动物实验相继成功[4-7] ，证实其有效性，效果可靠。本实验得到了相同的结论，即血管内皮生长因子基因转染大鼠皮瓣，4d断蒂，通过促进局部血管新生，增加血供，明显提高皮瓣成活率，促进早期断蒂。
本研究通过对目的基因组皮瓣不同部分研究发现，在皮瓣不同部位血管内皮生长因子基因转染促进血管增生数目不同，离皮瓣蒂部越远促进血管增生作用越明显，而靠近蒂部区域促血管增生作用不明显，有统计学意义(P&<0.05)。以往学者同类实验中大多只对皮瓣远端成活部分观察其促血管作用，很少对血管内皮生长因子基因组皮瓣不同部分进行多点观察其促血管作用。其机理可能是缺血部位相对缺氧，缺氧致血管内皮生长因子局部受体上调有关。由此可以得出血管内皮生长因子基因发挥作用除与转染率有关，更与其所发挥作用局部条件(缺血缺氧等)有关，或者其它原因，需我们进一步深入研究。
在本实验中，我们将脂质体包埋的重组质粒在术中一次注入大鼠皮瓣内，较传统实验采用病毒载体有更大安全性，操作简单，局部应用对全身其它系统影响小。利用局部注射基因治疗技术促进缺血皮瓣快速血管新生，从而提高皮瓣成活率和早期断蒂，为一切以血管化为中心环节的组织修复、创面愈合提供有效的治疗方法。随着基因疗法的研究深入，VEGF基因治疗将成为创伤、组织修复、组织移植等领域提高，加快血管化率的重要方法，有着广阔的前景，较之其它学科，可能更早应用于临床。
参考文献
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