【摘要】 目的：研究患糖尿病肥胖鼠（ob/ob）体内胰岛β细胞的黄素蛋白(Fp)、还原型辅酶(NADH)和焦脱镁叶绿酸标记的2-脱氧葡萄糖(Pyro-2DG)的荧光强度分布特点。方法：使用低温成像器(Cyro-imager)检验胰腺胰岛β细胞的氧化还原特性，观察胰腺胰岛β细胞内Pyro-2DG的累加情况。结果：通过获得的胰腺组织的2维影像图，使用三维可视化(Amira)医学专用软件可构建出3维高分辨影像。结论：这项研究成果有助于评估胰腺组织光学研究的有效性。
【关键词】 焦脱镁叶绿酸标记的2-脱氧葡萄糖；患糖尿病肥胖鼠；胰岛β细胞；3维高分辨影像
Abstract Objective: To study fluorescence intensity distribution of Fp， NADH and Pyro-2DG in pancreatic islet β cells and liver cells of obese-diabetic (ob/ob) mice. Methods: A cryo-imager was used to image the pancreas and liver and to examine the redox characteristics of the pancreatic islet β cells and the accumulation of Pyro-2DG in pancreatic islet β cells was observed. Results: High-resolution 3D images were constructed through 2D images of the serial sections of pancreas acquired using Amira medical software. Conclusion: This study helps to evaluate the validity of optical studies of pancreatic tissue.
Key word Pyropheophorbide 2-dexyglucose (Pyro-2DG); Obese-diabetic mice ; Pancreatic islet βcells;High-resolution 3D images
糖尿病是一种代谢系统疾病，与胰岛素分泌量少或胰岛素抵抗而引起的高血糖有关。治疗糖尿病的费用十分可观。据世界卫生组织预计，到2025年，全球成人糖尿病患者人数将增至3亿，而中国糖尿病患者人数将达到4 000万，未来50年内糖尿病仍将是中国一个严重的公共卫生问题[1]。因此，研究一种由功能性胰岛β细胞缺乏导致的糖尿病的无损诊断法十分必要。胰岛中包含有β细胞、α细胞、δ细胞、PP细胞。胰岛素可以促进机体利用吸收的葡萄糖而产生能量，由于β细胞缺损导致胰岛素分泌不足而引起糖尿病。胰胰岛细胞损伤程度与糖尿病病情及转归有直接关系，因此在胰腺组织中应用光学成像技术研究胰岛β细胞缺损程度前景十分乐观。
在研究中，使用同型结合突变型患糖尿病肥胖鼠(ob/ob)作为实验动物。该鼠具有肥胖和胰岛肥大的特点，可引起抗胰岛素性、代谢减退、低体温和胰岛素过剩等问题。此外，该鼠可以在低葡萄糖浓度的状态下分泌出高于正常量4倍的胰岛素。
1 材料与方法
1.1 仪器 低温成像器（Cryo-imager）可以对冷冻截留组织进行荧光强度成像。低温成像器包括液氮样本仓、铣刀头和具有步进电动机驱动光导的光扫描器（汞灯、激光二极管、冷光镜、光电倍增管、过滤器等）。黄素蛋白(Fp)发散光波长440nm、吸收光波长525nm，NADH发散光波长365nm、吸收光波长460nm，焦脱镁叶绿酸标记的2-脱氧葡萄糖（Pyro-2DG）发散光波长405nm、吸收光波长670nm。由计算机控制的扫描分辨率为128×128像素，光导的步长为80μm，每16毫秒采集1个像素，1个像素平均4个采样点。
1.2 动物样本的准备和低温成像器荧光成像 10只9周龄同型结合突变型患糖尿病肥胖鼠(ob/ob)随机分为实验组5只和对照组5只，将两组动物全部麻醉，实验组(ob/ob)鼠经尾部静脉注射0.05mg Pyro-2DG，对照组(ob/ob)鼠没有接受Pyro-2DG注射。麻醉2个小时后，在液态氮冷冻甲基乙烷中将胰腺冷冻截留，制作成实验用样品。样本在液氮样本仓中打磨后进行扫描，扫描自上而下进行。每一次，都在掠过样本100μm之下的相同位置开始扫描。连续断面经过一系列的扫描后，可获得FP、NADH、Pyro-2DG荧光强度数据。
2 结果与讨论
检测胰腺β细胞中葡萄糖的代谢是识别β细胞的有效方法，因为葡萄糖诱使胰岛素分泌与胰岛β细胞的代谢情况有关。在葡萄糖进入细胞后被氧化供能，随后代谢物增加，这些均可通过NADH/(Fp+NADH)氧化还原率指数进行监测。近些年来，在成像中使用了荧光葡萄糖诱导剂。Zheng等[2]合成一种与近红外(NIR)荧光葡萄糖相似的Pyro-2DG，这种Pyro-2DG可在快速代谢组织中抑制和聚积。
2.1 由胰岛摄入的Pyro-2DG特性及氧化还原状态 实验组老鼠胰腺内的Pyro-2DG信号很强，而对照组老鼠胰腺内则没有显示Pyro-2DG信号，这说明胰腺可吸收大量葡萄糖，见图1。这是因为当体内面临较高血糖浓度时，胰岛就会吸收更多的葡萄糖，以产生更多的能量合成能够降低血糖的胰岛素。因此，许多不可代谢的荧光葡萄糖Pyro-2DG-6-P在胰岛内潴留。
图1 胰腺NADH、Pyro-2DG、氧化还原率指数影像图
A 实验组，B 对照组
2.2 实验组NADH和Pyro-2DG的多层影像 使用Mat Lab程序，实验组动物胰腺的NADH和Pyro-2DG的多层影像可以通过连续的2维影像获得，幻灯片中所显示的实验组老鼠胰腺的全部Pyro-2DG信号分布均匀与NADH信号相似，这显示了能量代谢活跃区域。见图2。
图2 实验组胰腺NADH和Pyro-2DG的多层影像
2.3 实验组的NADH和Pyro-2DG的3维影像 实验组NADH和Pyro-2DG的3维影像可通过使用Amira软件从2维影像中获得。见图3。
图3 实验组胰腺Fp、NADH和Pyro-2DG的3维影像 以上图形清晰地表明，胰腺组织胰岛β细胞可以吸收Pyro-2DG，用低温成像器成像后可获取高清晰度3维图像。此项研究可用来评估胰腺组织光学研究的有效性，以此判断β细胞的缺损程度，Pyro-2DG的荧光强度能够显示胰腺β细胞的氧化还原代谢状态。这一点对于胰岛β细胞的功能成像很重要，对继续研究肥胖糖尿病鼠胰岛β细胞的剂量效应有指导作用。
参考文献
[1] 李永强， 冯志强， 宋宏锐，等.葡萄糖激酶及其小分子活化剂研究进展[J].药学学报，2006，41(5):390-393.
[2] Zhang M，Zhang Z，Blessington D，et al. Pyropheophorbide 2-Deoxyglucosamide: A New Photosensitizer Targeting at Glucose Transporters[J].Bioconjugate Chem，2003，14:709-714.
[3] Patterson GH，Knobel SM，Arkhammar P，et al.Separation of the glucose-stimulated cytoplasmic and mitochondrial NAD(P)H responses in pancreatic islet β cells[J].PNAS，2000，97:5203-5207.
[4] Nirmala R. Low temperature fluorescence imaging of freezetrapped human cervical tissues[J].Optical Express，2001，8:335-343.