关于肝癌细胞系MHCC97亚群中细胞角蛋白19的表达差异

【摘要】 目的：探讨细胞角蛋白（CK）19在肝癌细胞系不同细胞亚群的表达差异及其意义. 方法: 应用流式细胞荧光激活分选法将肝癌细胞分成边缘群(SP)及非边缘群(NonSP) 2个细胞亚群， 采用免疫细胞化学方法观察CK19在2个不同肝癌亚群中的表达变化及含量. 结果: SP细胞仅占细胞总体的1.8%， SP细胞CK19表达高于NonSP细胞(P&<0.01). 结论: CK19在肝癌细胞中表达有差异，强阳性多数分布在SP细胞亚群中，进一步证实了肿瘤的异质性，同时说明SP细胞具有双向分化潜能.
【关键词】 肝细胞肝癌 细胞角蛋白19 缘群 双向分化
　　 0引言
　　原发性肝癌的发生曾归因于成熟细胞的“去分化(dedifferentiation)”，但是，近来研究认为它可能由肝干细胞(HSC)分化不全或分化异常(disdifferentiation)所致［1］. 细胞角蛋白（cytokeratin， CK）的表达有组织和分化特异性. 在胚胎发育过程中，胚胎肝细胞中表达CK8， CK18， CK19，随着肝脏的分化，CK19在正常肝细胞不表达，只在胆管细胞中表达［2］. 当肝细胞发生癌变时，有些癌细胞又重新表达CK19，部分为分子结构不完整的CK19，且表达程度与细胞的分化程度呈负相关性［3］. 近年来，利用流式细胞荧光激活分选法可以获得组织中具有原始干细胞特征的成体细胞，利用类似的方法可以将肝癌细胞分成两个不同特征的亚群［3］，因此，探讨CK19在这两个不同亚群肝癌细胞中的表达差异对阐明和验证肝癌组织中是否存在具有干细胞特征的肿瘤细胞具有重要的意义.
　　1材料和方法
　　1.1材料MHCC97细胞系(人高转移肝癌细胞系)购自上海复旦大学中山医院肝癌研究所. 荧光染料Hoechst33342、钙离子通道拮抗剂维拉帕米、PI均购自Sigma公司； DMEM/F12培养基购自Invitrogen公司、抗CK19抗体及二抗(中杉金桥) 、FACS Advantage II型六色荧光流式细胞仪(美国BD 公司) 、IX70 Olympus激光共聚焦显微镜（日本Olympus公司).
　　1.2方法
　　1.2.1细胞培养复苏后的人肝癌细胞系MHCC97细胞中加入含有100 mL/L胎牛血清（FCS）和加入8×104 U/L青霉素、1×105 U/L链霉素的DMEM，50 mL/L CO2孵箱37℃孵育.
　　1.2.2边缘群(SP)细胞及非边缘群(NonSP)细胞的检测①细胞染色:MHCC97细胞常规消化， HBSS洗涤，制备成单细胞悬液，细胞密度为1×109/L. 等分细胞悬液，两组均加入荧光染料Hoechst 33342使终浓度为6 mg/L，其中一组再加入维拉帕米，终浓度50 mmol/L. 37℃避光水浴90 min，冰上10 min终止染色，冰预冷HBSS洗涤细胞并重悬浮，再加入PI使终浓度为2 mg/L. ②流式细胞仪检测: 355 nm UV激发光源， 610 nm双色短通反射滤镜， 450 nm和675 nm边缘长通滤片分别检测散射光蓝光及红光部分，线性模式采集信号. 测量前向散射和侧向散射二维参数图，检测细胞均一性，以Hoechst red为X 轴， Hoechst blue为Y轴作二维散点图，将低Hoechst red及低Hoechst blue且维拉帕米组缺失的区域设定为SP细胞的“门”(gate)，计算百分比，分选出SP细胞及NonSP细胞.
　　1.2.3CK19免疫细胞化学分析将两种细胞分别接种于盖玻片， 培养方法同前. 分别于培养4~10 h，每间隔1 h使用丙酮在-20℃固定细胞20 min，并使用含有1 mL/L吐温20的PBS液洗涤. 在使用山羊正常血清封闭1 h后，固定的细胞分别使用一抗鼠抗人CK19在湿盒内4℃过夜. 随后使用含有1 mL/L吐温20的PBS液洗涤，摇床摇洗20 min. 加入二抗FITC连接的山羊抗鼠IgG，37℃孵育2 h. 在PBS清洗后，使用300 mL/L的甘油缓冲液封闭细胞爬片，IX70显微镜进行观察. CK19 mAb最适工作浓度1∶100，二抗工作浓度为1∶500.
　　统计学处理: 用SPSS 11. 0统计软件包分析，采用配对t检验.
　　2结果
　　2.1SP细胞及NonSP细胞的分选前向散射和侧向散射二维参数图证明受检细胞大小、形态、胞质均匀性一致，无PI染色细胞，无杂细胞干扰. 二维散点图中Hoechst red为X 轴， Hoechst blue为Y轴，在细胞集中区域(P2)左下角(P1)另有小部分散点聚集(低Hoechst)，而维拉帕米拮抗组无此区域，即SP细胞. 占受检细胞的1.8%(图1). 对P1区域的SP细胞及P2区域的NonSP细胞进行分选，分别获得4×105及1×106个细胞.
　　Hoechst（烟酸己可碱）red为X轴， Hoechst blue为Y轴(P1区为SP细胞，P2为NonSP细胞).
　　图1流式细胞仪二维散点图
　　2.2CK19免疫细胞化学分析SP细胞及NonSP细胞爬片4 h后均贴壁，免疫细胞化学分析发现SP细胞及NonSP细胞胞质内均可见绿色荧光，其中SP细胞爬片可见许多强荧光显色. 我们利用ImagePro Plus5.0.2软件检测分别检测SP细胞和NonSP 细胞爬片的平均积分光密度（density mean），结果表明SP细胞及NonSP细胞中CK19的表达有统计学差异(图2，表1).表1SP细胞及NonSP细胞中CK19的表达
　　3讨论
　　肝细胞肝癌的发生机制是当前国内外肿瘤研究的热点领域. 有学者提出肿瘤细胞和干细胞都具有幼稚的细胞表型，并提出肿瘤的干细胞起源假说［4］. 随着研究的深入，已有多种方法应用于肿瘤组织中具有干细胞样特性的肿瘤细胞的分离. 利用干细胞对多种染料具有排斥性的特异性功能标志，结合荧光激活细胞分选法，可得到低荧光并表现为边缘性聚集的SP细胞［5］，目前这种分离富集干细胞样细胞的方法最为先进. 肿瘤细胞和干细胞在无限增值、多向分化及自我更新机制等方面具有相似性.

近年在乳腺癌、白血病、中枢神经系统肿瘤的研究中发现在肿瘤组织中只有少数细胞具有无限增生和致瘤的潜能［6］. CK的表达有组织和分化特异性. CK19作为胆管特异性标志在正常肝细胞不表达，只在胆管细胞中表达［2］. 当肝细胞发生癌变时，有些癌细胞又重新表达CK19，且表达程度与细胞的分化程度呈负相关性［3］. 日本学者Takahiro等［7］研究结果表明， 表达CK19的肝癌侵袭性更强，恶性程度更高. 另外一些研究者认为肝癌细胞表达胆管细胞特异性标志意味着其可能来源于恶变前的某种祖细胞［8-10］. 我们的研究通过流式细胞荧光激活分选法富集了干细胞样肝癌细胞，并用免疫细胞化学方法证实在肝癌细胞系MHCC97两个亚群都表达CK19，并且CK19的表达存在明显差异，仅极少部分细胞CK19表达呈强阳性，且绝大多数分布在SP细胞亚群中， 提示仅有少量克隆扩增、形成肿瘤及自我更新能力强的、更为原始的干细胞样肿瘤细胞高表达CK19，同时提示其具有向胆管上皮细胞分化的能力. 张宁等［11］研究发现AFP在两个亚群中也存在着差异，说明SP细胞亚群有着双向分化潜能，既可以向肝细胞方向分化，又可以向胆管上皮细胞分化. 而这部分细胞与肿瘤的发展、复发、转移及耐药关系更为密切，从而进一步证实了肿瘤的异质性.
【参考文献】
［1］ Sell S. Cellular origin of hepatocellular carcinomas［J］. Semin Cell Dev Biol， 2002， 13(6): 419-424.

［2］ Omary MB， Ku NO， Toivola DM. Keratins: Guardians of the liver［J］. Hepatology， 2002， 35(2): 251-257.

［3］ Wu F， Nishioka M， Fujita J， et al. Expression of cytokeratin 19 in human hepatocellular carcinona cell lines［J］. Int J Oncology， 2002， 20(1):31-37.

［4］ Reya T， Morrison SJ， Clarke MF， et al. Stem cells， cancer， and cancer stem cells［J］. Nature， 2001， 414(6859): 105-111.

［5］ Guo Y， Follo M， Geiger K， et al. Side population cells from different precursor compartments［J］. Hematother Stem Cell Res， 2003，12(1): 71-82.

［6］ Dao MA， Arevalo J， Nolta JA. Reversibility of CD34 expression on human hematopoietic stem cells that retain the capacity for secondary reconstitution［J］. Blood， 2003， 101(1): 112-118.

［7］ Takahiro U， Shoji K， Takatsugu Y， et al. Cytokeratin 19 expression in hepatocellular carcinoma predicts early postoperative recurrence［J］. Cancer Sci， 2003，94(10):851-857.

［8］ Uenishi T， Kubo S， Hirohashi K，et al. Expression of bile ducttype cytokeratin in hepatocellular carcinoma in patients with hepatitis C virus and prior hepatitis B virus infection［J］. Cancer Lett， 2002， 178(1): 107-112.

［9］ Sakon M， Umeshita K， Nagano H，et al. Clinical significance of hepatic resection in hepatocellular carcinoma: Analysis by diseasefree survival curves［J］. Arch Surg， 2000， 135(12): 1456-1459.

［10］ Poon RT， Fan ST， Ng IO，et al. Different risk factors and prognosis for early and late intrahepatic recurrence after resection of hepatocellular carcinoma［J］. Cancer， 2000， 89(3): 500-507.

［11］ 张宁，窦科峰，李韧，等. 肝癌细胞系MHCC97亚群中甲胎蛋白的表达差异［J］. 第四军医大学学报，2006，27（19）：1799-1801.

转贴于