关于缺血后处理减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤最佳方案

　　　　　　　　作者：孙静，董海龙，栾琪，赵翚，路志红，熊利泽

【摘要】 　　 目的： 探寻缺血后处理（IP）对大鼠局灶性脑缺血损伤保护作用的最佳时间，比较该处理方案与缺血预处理（IPC）脑保护效应. 方法： IP最佳时间确定实验分组：60只雄性SD大鼠，随机分为6组（n=10）. 对照组，行单纯缺血再灌注； IP15 s，30 s，1 min，2 min和5 min不同时间点组，分别于大脑中动脉线栓阻闭（MCAO）90 min后，再灌注15 s，30 s，1 min，2 min和5 min，缺血15 s，30 s，1 min，2 min和5 min，反复三次，组间比较得出IP最佳时间. 比较IP最佳时间与IPC脑保护效应实验分组：30只雄性SD大鼠，随机分为3组（n=10）. 对照组，IP15 s组和IPC组，预先阻闭大脑中动脉20 min，再灌注24 h后行MCAO 90 min. 上述实验90只动物经再灌注24 h后进行神经功能障碍评分. 取大脑行2，3，5氯化三苯四唑（TTC）染色确定脑梗死容积百分比，并行统计学分析. 结果： 再灌注24 h后，在IP最佳时间的确定实验中，IP15 s组神经功能评分和脑梗死容积（34.0±4.8）％明显低于对照组［（58.9±12.2）％， P&<0.01］；在IP与IPC脑保护效应比较实验中，IP15 s和IPC的神经功能评分与对照组相比差异具有统计学意义（P&<0.01），但IP15s脑梗死容积（36.1±10.3）％大于IPC组［（26.8±3.3）％， P&<0.01］. 结论： IP对大鼠局灶性脑缺血损伤保护作用的最佳时间为15 s再灌注/缺血，反复三次；IP的脑保护效应弱于IPC.
【关键词】 缺血后处理；缺血预处理；再灌注损伤；脑
　　【Abstract】 AIM: To investigate the optimal protocol of ischemic postconditioning (IP) against focal cerebral ischemiareperfusion injury， and compare the effect of IP with that of ischemic preconditioning (IPC). METHODS: To confirm the optimal protocol of IP， 60 male SD rats weighing 290310 g were randomly assigned to 6 groups (n=10 each): control group and IP groups with different time intervals (15， 30 s， 1， 2 and 5 min). IP was performed by three cycles of reperfusion/ischemia (R/I) at different time intervals (15， 30 s， 1， 2 and 5 min respectively) after middle cerebral artery occlusion (MCAO) for 90 min. To compare the effect of IP with that of IPC， 30 male SD rats weighing 290310 g were randomly assigned to 3 groups (n=10 each): control group， IP15s and IPC. The rats in IP group were subjected to 3 cycles of R/I after 90 min MCAO at the best time interval(15 s). The rats in IPC group were subjected to 20 min MCAO 24 h before 90 min MCAO. The neurological deficit scores (NDS) were evaluated 24 h after reperfusion， and the 90 animals were sacrificed. Infarct volume， as a percentage of volume at normal cerebral hemisphere， was determined by 2， 3， 5triPhenyltetrazolium (TTC) staining. RESULTS: NDS was significantly lower and the infarct volume was significantly smaller in IP15 s group ［(34.0±4.8)% ］compared to that of control group［(58.9±12.2)%， P&<0.01］ 24 h after the reperfusion. The NDS in IP15 s group and IPC group were better than that in control group. The infarct volume in IP15 s group ［(36.1±10.3)%］ was larger than that in IPC group ［(26.8±3.3)%， P&<0.01］. CONCLUSION: The optimal protocol of IP to induce ischemic tolerance in brain is three cycles of R/I (15 s/15 s). And the neuroprotection induced by IPC is stronger than that by IP.
　　【Keywords】 ischemic postconditioning; ischemic preconditioning; reperfusion injury; brain
　　 0引言
　　脑缺血可造成神经元的不可逆性损伤，寻找有效预防和治疗神经损伤的方法是目前研究的难点和热点. 缺血预处理（ischemic preconditioning， IPC）可减轻脑的再灌注损伤，但由于脑缺血的发生具有不可预知性，故其应用具有一定的局限性［1］. 有学者在兔心肌缺血再灌注模型发现，冠脉阻闭40 min后间断开放和阻闭冠脉，可明显减小梗死面积，以此提出 “缺血后处理”（ischemic postconditioning， IP）的概念［2］. 既往研究证实脑组织缺血再灌注前，行短暂的重复缺血亦可减轻再灌注损伤［3］. 但IP选用何种时长和间隔才产生最显著的脑保护效应，而这种保护效应与预处理比较孰强孰弱，目前少见报道. 本研究旨在探讨在体情况下IP的最佳时间方案，并比较与预处理脑保护效应的强弱，为其的临床应用提供实验依据.
　　1材料和方法
　　1.1材料健康雄性SD大鼠90只，体质量290～310 g（由第四军医大学实验动物中心提供）；30尼龙线（日本 Ethicon 公司）；DC240型数码相机（美国 Kodak 公司）.
　　1.2方法
　　1.2.1动物分组IP最佳时间确定实验分组：SD大鼠60只，随机分为6组，每组10只. 对照组： 行单纯缺血再灌注；IP15 s，30 s，1 min，2 min和5 min不同时间点组：于大脑中动脉线栓阻闭（middle cerebral artery occlusion， MCAO） 90 min后，分别在15 s，30 s，1 min，2 min和5 min进行再灌注/缺血处理，反复三次. 比较IP最佳时间与IPC脑保护效应实验分组：SD大鼠30只，随机分为3组，每组10只. 对照组： 行单纯缺血再灌注；IP最佳时间组和IPC组：事先给予大脑中动脉阻闭20 min，再灌注24 h后行MCAO 90 min.
　　1.2.2模型制作所有实验动物术前24 h禁食，自由饮水. 按文献［3］的方法制作大鼠局灶性脑梗死模型，面罩给予40 mL/L异氟醚麻醉，术中保留自主呼吸，取颈正中切口，暴露右侧颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉. 结扎颈总动脉、颈外动脉，于颈总动脉分叉下方剪一切口，将一预先用酒精灯烧成圆头的30尼龙线置入颈内动脉17～18 mm，直到有轻微阻力感为止，阻闭90 min后抽出尼龙线，恢复再灌注. IP于MCAO 90 min后，将尼龙线拔出5～8 mm，依据分组，再灌注时间于15 s，30 s，1 min，2 min和5 min后，再将尼龙线放入原位置，缺血时间分别为15 s，30 s，1 min，2 min和5 min，反复三次. IPC用动脉夹夹闭颈总动脉，于颈外动脉分叉上方剪一切口，将一预先用酒精灯烧成圆头的30尼龙线置入颈内动脉17～18 mm，直到有轻微阻力感为止，阻闭20 min后抽出尼龙线，恢复再灌注24 h.
　　1.2.3观测指标
　　1.2.3.1神经行为学评估麻醉苏醒后，将动物放回鼠笼，自由饮食. 脑缺血再灌注后24 h，按文献［4］的方法双盲法评估记录神经功能障碍评分：0级：无功能障碍；1级：不能伸展左侧前肢；2级：向左侧旋转；3级：向左侧倾倒；4级：无自主活动伴有意识障碍；5级：死亡.
　　1.2.3.2脑梗死灶测量完成神经功能障碍评分后，将动物用氯胺酮深麻醉后断头处死，迅速取出鼠脑，置于冰盐水中10 min，取冠状面均匀切成2 mm厚脑片，迅速放入20 g/L的2，3，5氯化三苯四唑（TTC）溶液（37℃）中染色30 min，然后用40 g/L甲醛固定. 24 h后将脑片用数码相机拍照，输入计算机，采用双盲法用图像处理软件（ADOBE PHOTOSHOP 7.0）计算梗死容积（粉红色区为正常脑组织，白色区为梗死区）百分比，即梗死灶占对侧正常大脑半球的百分比.
　　统计学处理： 资料分析采用SPSS 11.0统计分析软件，脑梗死容积以x±s表示，梗死容积百分比采用单因素方差分析及两两比较，神经功能障碍评分比较采用KruskalWallis H法后行Bonferroni校正，再利用MannWhitney法进行两两比较，P&<0.05为差异具有统计学意义.
　　2结果
　　2.1神经功能障碍评分比较术后所有动物均存活. 缺血再灌注后动物均表现一定神经功能障碍. 缺血再灌注24 h后，在IP最佳时间的确定实验中，与对照组相比，IP15 s， 30 s， 1 min和2 min 组神经功能评分显著降低（P&<0.01），尤以IP15 s组神经功能评分强于其它各组（P&<0.05）. 而IP5 min组与对照组相比较差异无统计学意义（P=0.739，表1). 在IP与IPC脑保护效应比较的实验中，IP组和IPC组神经功能评分显著低于对照组(P&<0.05，表2). 表1IP最佳时间确定的实验中大鼠再灌注24 h后神经功能障碍评分
　　2.2大鼠脑梗死容积变化缺血再灌注24 h后，在IP最佳时间的确定实验中，脑梗死容积百分比：IP15 s组为（34.0±4.8）％，IP30 s组为（41.5±12.0）％，IP1 min组为（48.4±7.3）％ ，IP2 min组为（45.5±10.4）％，明显小于对照组［（58.9±12.2）％， P&<0.01］，而IP5 min组（58.4±9.6）％与对照组相比较差异无统计学意义（P=0.922）. IP15 s组和IP30 s组脑梗死容积显著小于其它各组（P&<0.05，图1）. 在IP与IPC脑保护效应比较的实验中，IP15 s组（36.1±10.3）％和IPC组（26.8±3.3）％脑梗死容积小于对照组［（54.7±9.5）％， P&<0.01］. IP15 s组脑梗死容积大于IPC组（P=0.018，图2）. 表2IP最佳时间与IPC脑保护效应比较的实验中大鼠再灌注24 h后神经功能障碍评分图2IP最佳时间与IPC脑保护效应比较的实验中大鼠再灌注24 h后脑梗死容积的比较

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　　MCAO模型和神经功能障碍评分是脑保护机制研究中最常用的技术平台，目前国际上应用颇为广泛［3-4］. 本实验应用MCAO模型，证实了短暂的IP可改善由于阻闭大鼠大脑中动脉所引起的神经功能改变并可降低脑梗死容积，这提示IP的最佳处理时间方案为15 s，反复三次. 但是，IP的神经保护效应弱于IPC.
　　目前关于IP减轻脑损伤机制尚不明了. 心脏的初步研究显示，只有在缺血再灌注早期，IP可以减轻炎症反应和改善氧自由基代谢［5］，激活再灌注损伤清除激酶信号［6］，抑制线粒体敏感性转化孔的开放，从而减少了细胞的凋亡和坏死，起到了器官的保护作用［7-8］. 而本实验恰恰证明了脑IP保护效应也在脑缺血再灌注的早期发生，并且明确了不同时间点所产生保护效应的强弱，得出了IP15 s组脑保护效应最为明显，而IP5 min组相对于其它时间点的IP属于最晚期的IP时间组，其对器官的保护效应消失. 在兔心肌缺血再灌注模型于再灌注前10 min内实施IP，可明显减小梗死面积，而延迟10 min则保护效应消失［9］. 因此，IP对器官的保护在早期实行十分重要. 但脑的IP具体保护机制是否与心脏一致，还有待进一步的研究证实.
　　IPC主要施加于缺血之前，其主要是针对缺血性损伤和再灌注损伤给予的预防保护措施，可增加组织对缺血的耐受性. 而IP则施加于复灌初期，只是作用于再灌注损伤初期，可能原因是IPC强于IP保护作用的原因所在. 由于患者脑缺血发生的不可预知性大大影响了IPC在临床的可操作性，而IP则可克服此局限性，具有良好的临床应用前景，为今后揭示IP脑保护的分子机制以及临床应用提供了实验依据.
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