关于护骨素基因启动子区T149 C基因型和等位基因频率分布的区域性差异

【摘要】 目的: 探讨绝经后汉族妇女护骨素(OPG)基因启动子区T149C基因型和等位基因频率在中国大陆不同区域存在的分布差异. 方法: 用聚合酶链反应限制性片断长度多态性（PCRRELP）测定随机选取的89例西安市绝经后正常妇女和72例广州市绝经后正常妇女OPG基因T149C的基因型. 结果: 所选人群OPG基因T149C基因型频率分布在两地绝经正常妇女中均符合HardyWeiberg定律，而且其基因型在两组研究对象中分布差异有统计学意义（P&<0.01）. 结论: 绝经后汉族妇女OPG基因启动子区T149C基因型和等位基因频率分布可能存在着区域性差异.
【关键词】 护骨素 多态性 启动子 基因 突变
　　0引言
　　护骨素(osteoprotegerin， OPG) 是TNF受体超家族成员，是由该前肽(401个氨基酸)切除21个氨基酸的信号肽产生的成熟肽(380个氨基酸)，是目前已知唯一一个通过与定位于成骨细胞膜上的NFkB受体活化剂配体(receptor activation of NFkB ligand， RANKL)结合，从而封闭了成骨细胞诱导的破骨细胞分化成熟及其溶骨性骨吸收的可溶性饵受体［1］，与其他成员相比，OPG缺少跨膜域和细胞质区域，而OPG基因启动子区序列的变化可能影响到基因的转录和蛋白质表达水平［2］. 我们用限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism， RFLP)分析技术对绝经后中国大陆不同区域的汉族妇女OPG基因启动子T149C多态性进行分析，以期了解其基因型和等位基因频率在中国大陆不同区域是否存在着分布差异.
　　1对象和方法
　　1.1对象组Ⅰ为89例在陕西西安市居住10 a以上，平均年龄63.2（49~79）岁的绝经后正常妇女，组Ⅱ为72例在广东广州市居住10 a以上，平均年龄62.8（46~77）岁的绝经后正常妇女，彼此无亲缘关系，自然绝经时间超过5 a.同时不具有以下情况的汉族妇女作为研究对象，即除外甲亢、甲旁亢、糖尿病、皮质醇增多症、多发性骨髓瘤等所致的骨质疏松症患者，除外类风湿性关节炎、恶性肿瘤、消化道疾病及动脉粥样硬化患者，近期使用VD、钙剂、降钙素、雌激素及激素替代药物等影响骨代谢的药物的妇女. 调查和取样均征得受试者本人同意.
　　1.2方法
　　1.2.1引物设计与合成引物按GenBank网站(编号:AB 008821)和文献［3］提供的OPG基因启动子序列，用Primer Premier 5软件设计，引物序列为:上游引物5′CTGGAGACATATAACTTGAACA3′，下游引物，5′CCATCATCAAACCCCTATTGGT3′(上海生物工程公司合成)，特异性扩增产物的片段为300 bp.
　　1.2.2DNA的提取外周静脉血2 mL，肝素抗凝，采用TaRaKa公司的试剂盒从全血中提取基因组DNA，提取的DNA溶于TE缓冲液，-20℃保存备用.
　　1.2.3PCRRFLP反应PCR反应体系为20 μL，其中基因组DNA 0.2 μg; 10×Ex Taq扩增缓冲液;上、下游引物各0.2 μmol/L; dNTP各200 μmol/L; Ex Taq DNA聚合酶1 U， PCR反应程序: 95℃预变性10 min后进行热循环.每个循环条件是: 94℃热变性1 min，51℃复性4 s， 72℃延伸1 min，共进行38个循环，循环完成后再于72℃延伸8 min. 5 μL反应产物于15g/L的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察扩增是否成功. 扩增产物为300 bp，取3个样本测序确认，其余经15 g/L琼脂糖凝胶电泳确定后，取PCR产物加过量的限制性内切酶XbaⅠ经37℃消化后，在25 g/L琼脂糖凝胶中分离酶解产物，紫外灯下确定基因型.
　　统计学处理: 采用SPSS11.0统计软件. χ2检验判断OPG基因启动子区T149基因型是否符合HardyWeinberg遗传平衡定律.
　　2结果
　　134例受试者经序列分析后在OPG基因启动子区找到了单核苷酸多态性T149C位点(图1). 两组实验对象均检测到TT型、CC型和CT型三种基因型，存在XbaⅠ酶切位点的纯合子TT，显示153 bp和147 bp两条带;缺乏XbaⅠ酶切位点的野生型纯合子CC，显示300 bp一条带;杂合子TC则显示上述三条带(图2). OPG基因启动子区T149C基因型和等位基因频率分布见表1，其等位基因在组I和组II中的频率分布符合HardyWeinberg遗传平衡定律，经χ2检验组Ⅰ与组Ⅱ绝经后正常妇女基因启动子区T149C基因型分布有统计学意义(χ2=70.41， P=0.000).
　　图1OPG基因启动子区单核苷酸多态性T149C位点（箭头所示）
　　3讨论
　　骨质疏松症是一种多因素病症，它的发生是多因素的结果，该病的骨量降低是环境因素和遗传因素共同作用的结果，即便在相同生理环境下，是否发病仍存在着个体差异. 近年来遗传因素日益受到重视，它在骨质疏松的发生中占50%~70%［2］. 在双生子和家系的研究中显示，85%骨密度的差异是由遗传因素所决定的［2，4］. OPG是近年发现的一种骨代谢分泌性调节蛋白，其在调节骨代谢方面的重要性已经被证实.目前多组研究发现OPG基因启动子和内含子多态性主要与下列位点有关: T149C， A163G， G209A， T245G， C889T， T950C， G1181C， A6890C. 研究发现，163， 209， 245和1181位点与腰椎骨密度降低或骨折相关［4］.许多国家对这些部位的基因多态性与绝经后骨质疏松及老年性骨质疏松的骨量和骨代谢指标的相关性进行了研究，结果各不相同.本研究结果显示：西安市和广州市161名绝经后汉族妇女OPG基因启动子区T149C多态性等位基因频率分布符合HardyWeiberg遗传平衡定律. 国内武兆忠等［5］发现T950C基因型频率分布与高加索人种妇女差异有显著性，高加索人种妇女CC型基因型分布频率无论是骨质疏松症组还是非骨质疏松症组均明显高于汉族妇女，分别占24.20%和22.39%［6-7］，而汉族妇女两者仅为8.2%和4.9%.但TT型基因型分布频率无论是骨质疏松症组还是非骨质疏松症组又低于汉族妇女.显然，基因启动子区T950C基因多态性频率分布存在着种族差异［8］，而同一种族内部是否也同样存在着基因多态性频率分布差异，目前无论是国内还是国外都无相关的报道. 本研究以西安市和广州市长期居住的汉族妇女为研究对象，以期解开这个疑问.
　　在本次研究中我们检测了OPG基因T149C的基因型，共发现三种基因型即TT， TC和CC. 其中西安市绝经后正常妇女基因T149C基因型以TT型为主，占72.25%，而广州市绝经后正常妇女基因T149C基因型以TC型为主，占81.54%，二者差异有统计学意义（P&<0.05）. 武兆忠等［9］在134例广州地区居住10 a以上相互之间无亲缘关系的绝经汉族女性的OPG启动区中亦找到了T149C单核苷酸点突变多态性位点，且也以TC型为主，占60.3%. 而隋满姝等［10］在我国东北地区用同样的方法测定126例在当地居住10 a以上相互之间无亲缘关系的绝经汉族女性的OPG启动区时却发现T149C单核苷酸点突变多态性位点以TT型为主，占81.75%. 这与我们的研究结果一致，据此我们认为护骨素基因启动子区T149C基因多态性频率分布在同一种族内也可能存在着差异，推测可能与我国不同历史时期多民族的融合有关.

我国的民族群体传统上分为南北两大部分，两大部分并不是截然分开的，它们之间有着明显的相互融合现象. 纵观我国历史，总体上汉族是在不断地由北向南迁徙的过程，在此过程中融合了不同民族，如苏沪皖一带多为中原汉族与江南土生汉族混血，江南土生汉族发源于河姆渡文化，而广东、广西多为汉人与南越人混血后裔，两广和福建的客家人为中原汉族直系后裔. 广西的壮族为古南越居民，广西的京族与越南人同源. 海南为汉人与南越、闽越混血，海南黎族说闽语，黎族为闽越直系后裔［11-12］. 非同源的人群在相同的环境条件下可以向相同的方向进化发展，从而形成相同的体质特征. 杜若甫等［13］认为不同民族相互融合的结果便发生了基因交流，这于我们的观点一致.
　　在本次实验中我们研究了中国大陆不同区域绝经后汉族妇女OPG基因启动子区T149C基因多态性频率分布情况，并发现了其在同一种族内区域性上的分布差异性，这就为骨质疏松性疾病的病因与发病机制的探讨提供了借鉴. 至于T149C多态性对骨密度水平是否有明显影响，我们在本次实验中未作进一步的研究. 但国内最近有学者以上海地区绝经后妇女为研究对象，结果显示T149C多态性对骨密度水平有明显影响，同时发现各基因型在除股骨颈以外的其他部位的骨密度差异无显著意义，但骨密度表现出TT&>TC&>CC的趋势，即携带T等位基因的骨密度较高，等位基因T可能是骨量的保护因子，我们将对这一课题作进一步的研究.

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