关于柴胡皂甙d对狼疮肾炎的治疗作用

【摘要】 目的：观察柴胡皂甙d (SSd)对NZBWF1狼疮肾炎小鼠的疗效. 方法：20只雌性NZBWF1小鼠分为3组：SSd治疗Ⅰ组［n=8，SSd腹腔注射，2 mg/(kg·d)］，SSd治疗Ⅱ组［n=6，SSd，4 mg/(kg·d)］，空白对照组(n=6)，共治疗6 wk. 结果：与空白对照组相比，SSd治疗组的尿蛋白含量，血清肌酐(SCr)和抗dsDNA抗体(AdsDNA)水平以及肾组织 IL6和IL10 mRNA表达降低，血清皮质酮(CS)水平升高，差异有统计学意义(P&<0.05)；肾小球细胞增生、变性、渗出、硬化和足突融合现象得到改善，肾小管受损百分比降低，电子致密物沉积减少，IgG， IgA和IgM在肾小球的沉积也减少. 结论：SSd对NZBWF1狼疮肾炎小鼠有治疗作用.
【关键词】 柴胡皂 狼疮肾炎 小鼠 治疗
　　 0引言
　　狼疮肾炎(lupus nephritis， LN)的治疗一直是医学上的一大难题，目前尚无理想的治疗方法. 柴胡皂甙d(Saikosaponind， SSd)是从中药柴胡中提取的主要活性成分，有糖皮质激素(GC)样甾环结构，国内外很多研究表明其具有抗炎、免疫抑制和免疫调节作用［1-2］. 本研究应用SSd治疗NZBWF1自发LN小鼠， 研究其对LN小鼠的治疗作用及可能的作用机制.
　　1材料和方法
　　1.1材料雌性NZBWF1 LN小鼠20只，18 wk龄，体质量25～30 g，由南京大学模式动物研究所暨国家遗传工程小鼠资源库购进，实验动物质量合格证号0010551，实验动物使用许可证号SCXK(苏)20050002. 饲养于中山大学实验动物中心层流柜中. SSd购自昆明风山渐医药研究有限公司，于中山大学测试中心用高效液相色谱法(HPLC)测得纯度为98.8％；小鼠血清皮质酮(CS)ELISA试剂盒购自美国ADL公司；小鼠血清抗dsDNA ELISA试剂盒购自美国ADI公司；逆转录试剂盒和Marker购自Fermentas公司；抗小鼠IgA(α链特异性)、IgG(γ链特异性)和IgM(μ链特异性)异硫氰酸荧光素(FITC)直接免疫荧光抗体均购自美国Sigma公司.
　　1.2方法
　　1.2.1实验动物分组将实验动物随机分为3组：SSd治疗Ⅰ组［n=8，SSd腹腔注射，剂量2 mg/(kg·d)，浓度0.2 g/L］； SSd治疗Ⅱ组［n=6，4 mg/(kg·d)，浓度0.4 g/L］；空白对照组［Ⅲ组，n=6， 腹腔注射无菌生理盐水10 mL/(kg·d)］. 于实验第6周末处死3组全部小鼠，取血及肾组织标本.
　　1.2.2各组小鼠血尿指标的检测实验的第2，4，6周末，收集各组小鼠尿液，用考马斯亮蓝法检测尿蛋白含量(mg/L)；自动生化分析仪测定血清肌酐(SCr) (μmol/L)；酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清皮质酮(CS) (nmol/L)；ELISA测定血清抗dsDNA抗体(AdsDNA) (A450 nm).
　　1.2.3各组小鼠肾组织学检查HE， PAS染色，光镜观察肾组织病变情况，对肾小球和肾小管损伤程度进行评分 ［3］： 每例肾组织观察20个肾小球横断面，对每个肾小球进行半定量评分. 计算受损肾小管比例(200个随机选择的肾小管中扩张、萎缩、坏死的肾小管所占的百分比). 电镜观察系膜区、内皮下、基底膜内、上皮下是否有电子致密物沉积；上皮细胞足突是否融合［4］. 免疫荧光（immunofluorescence， IF）观察肾组织IgA， IgG， IgM的沉积，根据荧光强度来判断免疫复合物的多少，选取10个肾小球用半定量法进行评分［4］.
　　1.2.4肾脏组织IL6和IL10 mRNA表达的检测从Nucleotide中查找小鼠IL6， IL10 和βactin基因序列，应用PrimerPremier 5.0引物设计软件，进行引物设计. ①IL6引物序列：上游5′ GTGGCTAAGGACCAAGACCA 3′，下游5′ TTCCAAGAAACCATCTGGCTA 3′；② IL10引物序列：上游5′ TCCTTGGAAAACCTCGTTTG 3′，下游5′ CTTCAATTGCTTCCCAAGGA 3′；③βactin引物序列：上游5′ GCGCTTTTGACTCAGGAT TT 3′，下游5′ CCTGGGCCATTCAGAAATTA 3′. 所有引物均由上海生物工程公司合成. 采用RTPCR和紫外图像分析技术检测小鼠肾组织IL6，IL10 mRNA表达. 实验6 wk末，取小鼠肾组织提取总RNA，逆转录合成用于PCR扩增的cDNA第一链. IL6， IL10和内参照βactin PCR扩增产物长度分别为395， 245和366 bp，三者的PCR扩增条件是：95℃变性5 min后，94℃ 30 s，56.1， 57.4， 53.2℃ 30 s (IL6/IL10/βactin)，72℃ 1 min，30个循环，最后72℃延伸7 min. 取IL6，IL10 和βactin PCR产物各3 μL， 加样于20 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳， 用凝胶成像系统定量分析DNA含量， 以所测得积分吸光度与内参照βactin积分吸光度的比值代表半定量值.
　　统计学处理：计量资料以x±s表示，组间比较采用方差分析，两两比较用SNKq检验(StudentNewmanKeuls法). 统计结果以P&<0.05为有统计学意义. 所有数据采用SPSS 13.0统计软件包处理.
　　2结果
　　2.1尿蛋白含量SSd治疗Ⅰ组和SSd治疗Ⅱ组尿蛋白含量低于空白对照组(P&<0.05)； SSd治疗Ⅱ组尿蛋白含量低于Ⅰ组(P&<0.05， 表1). 表1各组小鼠尿蛋白含量
　　2.2SCr， CS和AdsDNA水平实验6 wk后，与空白对照组相比，SSd 治疗Ⅰ组和Ⅱ组SCr和AdsDNA水平均降低(P&<0.05)，CS水平升高(P&<0.05)；与 SSd 治疗Ⅰ组相比，SSd治疗Ⅱ组CS水平升高(P&<0.05)，AdsDNA水平降低(P&<0.05)，而SCr水平下降不明显(P&>0.05， 表2).表2各组小鼠SCr， Cs和AdsDNA水平
　　2.3肾组织学检查实验6 wk后，光镜观察可见SSd 治疗Ⅰ组和Ⅱ组与空白对照组相比，肾小球内皮细胞和系膜细胞增生、变性、渗出、硬化和足突融合现象得到改善，肾小管受损百分比降低(P&<0.05， 表3， 图1). 表3各组小鼠肾组织染色肾小球评分及受损肾小管比例电镜检查可见，Ⅰ组和Ⅱ组分别可见足细胞足突广泛性融合和节段性融合，无电子致密物沉积(如箭头所示)（图2A， B）；Ⅲ组可见内皮下、上皮下以及系膜区电子致密物沉积(如箭头所示)（图2C）.
　　IF检测各Ig在肾小球系膜区和肾小球毛细血管壁的沉积，发现SSd治疗Ⅱ组，与SSd治疗Ⅰ组和空白对照组相比，IgG沉积减少(P&<0.05)，而SSd治疗Ⅰ组和空白对照组之间无统计学差异(P&>0.05)；SSd治疗Ⅰ组和Ⅱ组与空白对照组相比，IgA沉积减少(P&<0.05)，而SSd治疗Ⅰ组和SSd治疗Ⅱ组之间无统计学差异(P&>0.05)；SSd治疗Ⅱ组与空白对照组相比，IgM沉积减少(P&<0.05)， 而SSd治疗Ⅰ组与空白对照组、 SSd治疗Ⅰ组与SSd治疗Ⅱ组之间无统计学差异(P&>0.05， 表4).
　　A：SSd治疗Ⅰ; B：SSd治疗Ⅱ; C：空白对照.
　　图1肾组织光镜检查结果HE ×400
　　2.4肾组织IL6，IL10 mRNA表达实验6 wk后， SSd治疗Ⅰ组和Ⅱ组肾组织IL6和IL10 mRNA表达水平低于空白对照组(P&<0.05)；SSd治疗Ⅱ组肾组织IL6和IL10 mRNA表达水平低于SSd治疗Ⅰ组(P&<0.05， 图3).A：SSd治疗Ⅰ; B：SSd治疗Ⅱ; C：空白对照. 表4各组小鼠肾组织 IgG， IgA和IgM沉积评分
　　3讨论
　　LN传统治疗方法为糖皮质激素加免疫抑制剂，常不能有效控制病情活动，而且长期大量应用上述药物可增加感染、心力衰竭、肾功能衰竭等并发症的发生. 因此，发掘新药、探索有效的治疗方法是亟待解决的问题.

　　柴胡皂甙是中药柴胡的主要成分之一，其最具活性的成分是SSd，很多研究表明SSd具有抗炎、免疫抑制和免疫调节作用. 早在1986年，Abe等 ［5］发现SSd可以显著减少氨基核甙肾病模型大鼠的蛋白尿. 此后陆续有学者发现SSd具有减少尿蛋白，抑制细胞增生，改善肾组织病理等作用［6-8］. 本研究结果显示，SSd能够减少NZBWF1小鼠尿蛋白含量，降低小鼠SCr水平和AdsDNA水平. IF结果显示，经过SSd 治疗，小鼠肾小球系膜区和毛细血管壁IgG， IgA和IgM的沉积明显减少，表明SSd可以干扰和去除原位免疫复合物的形成，从而减轻肾脏炎症发生. 本研究还显示SSd不同程度地改善了NZBWF1小鼠肾小球内皮细胞和系膜细胞增生，透明变性，渗出，肾小管萎缩、扩张，内皮下、上皮下以及系膜区电子致密物沉积等病理改变.
　　我们曾报道在被动性Heymann肾炎的大鼠模型中， 无论疾病早期或晚期给予SSd，血清中CS、肾组织中糖皮质激素受体均有所增高［8］. 本研究同样发现SSd治疗后，NZBWF1小鼠血清CS水平明显升高，尤以大剂量为甚. 提示SSd可能通过使内源性CS合成或分泌增多，从而发挥其抗炎和免疫抑制作用，减轻炎症介质引起的肾组织损伤.
　　近年来大量研究表明细胞因子异常在LN的发病中发挥重要作用. 研究发现，与正常对照相比，LN患者血浆IL6和可溶性IL6受体的浓度均升高，52% LN患者肾活检标本有IL6蛋白和mRNA表达［9］. 用雷公藤干预肾系膜细胞，可以减少IL6的产生，从而减缓肾脏疾病的进展［10］. IL10是主要由B细胞产生的多功能细胞因子，Chan等［11］发现活动性LN患者肾活检组织中肾小球白细胞浸润的程度与肾小球IL10的表达显著相关. 本实验结果显示SSd治疗组NZBWF1小鼠肾组织IL6和IL10 mRNA表达减少，显著低于空白对照组，且随着治疗剂量的增加，IL6和IL10 mRNA表达下降更为明显，提示SSd可能通过减少IL6和IL10等细胞因子在肾组织的异常表达，减轻局部的细胞和体液免疫应答，从而减少其介导的肾组织免疫炎症损伤.

参考文献

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