关于银杏叶提取物对哮喘小鼠气道重塑的影响及机制

【摘要】 目的：探讨哮喘小鼠气道重塑与基质金属蛋白酶9（MMP9）的关系以及银杏叶的干预作用. 方法：建立哮喘小鼠气道重塑模型，40只BALB/c小鼠按随机数字法分为4组：对照组，哮喘组，银杏叶干预组，地塞米松干预组. 以鸡卵清蛋白（OVA）致敏并激发制备小鼠慢性哮喘模型. 对肺组织切片行苏木精伊红染色观察气道重塑情况. RTPCR检测各组小鼠肺组织MMP9 mRNA表达. 结果：哮喘组动物出现管壁增厚、平滑肌增生、黏液分泌增加等气道重塑的特征性改变，MMP9 mRNA水平增高. 地塞米松干预组和银杏叶干预组与哮喘组比较，炎症反应轻微，平滑肌增生、粘液分泌不明显，MMP9 mRNA水平表达降低，与对照组比较差异有统计学意义. 结论：长期吸入变应原可导致气道重塑，MMP9在气道重塑中发挥了作用，银杏叶的干预作用说明在血小板活化因子（PAF）和MMP9之间可能存在某种联系.
【关键词】 哮喘 MMP9 道重塑 银杏叶
　　0 引言
　　气道重塑是慢性哮喘反复发作的重要病理生理基础，它与哮喘肺功能损害及气道高反应性密切相关［1］. MMP9是锌依赖性蛋白酶，主要降解Ⅳ型以及Ⅴ型胶原. 近来研究表明MMP9在支气管哮喘患者的气道炎症和组织重塑中发挥重要作用［2］. 此外，PAF是引起气道变应性炎症的主要炎性介质之一，研究表明银杏叶是PAF的有效抑制剂［3］. 本文旨在通过银杏叶对PAF的拮抗作用，来探讨小鼠哮喘气道重塑模型中PAF与MMP9的关系.
　　1 材料和方法
　　1.1 材料 清洁级BALB/c小鼠，6～8 wk，40只，雌雄各半，体质量（16±4）g，购于第四军医大学实验动物中心. 鸡卵清蛋白(ovalbumin，OVA)，Ⅴ级，购于Sigma公司. 银杏叶提取物（Ginkgo biloba extract，Egb，含240 g/L银杏黄酮苷，60 g/L银杏内酯，5 mL，批号：0404018)，购于德国威玛舒培大药厂. Trizol购于Invitrogen公司，反转录试剂盒和PCR试剂购于Toyobo公司，MMP9及GAPDH引物由上海鼎安生物科技有限公司合成.
　　1.2 方法
　　1.2.1 小鼠哮喘模型的建立 40只小鼠按随机数字法分为4组：对照组，哮喘组，地塞米松干预组，银杏叶干预组. 小鼠适应性饲养1 wk后，采用卵蛋白致敏和激发建立慢性哮喘小鼠模型. 哮喘组、地塞米松干预组、银杏叶干预组分别于第0， 7， 14 d腹腔注射0.2 mL致敏液（含OVA 300 mg，氢氧化铝100 mg）. 第15日开始每日以25 g/L OVA雾化激发，30 min/d，共6 wk；地塞米松干预组每次激发前1 h腹腔注射10 mg/kg地塞米松注射液；银杏叶干预组每次激发前1 h腹腔注射100 mg/kg Egb；哮喘组每次激发前1 h腹腔注射0.2 mL生理盐水，对照组于第0， 7， 14日腹腔注射0.2 mL生理盐水，15 d始用生理盐水雾化6 wk. 末次刺激后24 h处死动物［4］.
　　1.2.2 取材 小鼠颈椎脱臼处死，取出左肺投入100 g/L中性福尔马林中固定24 h. 肺标本石蜡包埋切片. 取右肺，PBS冲洗后即投入液氮中备用.
　　1.2.3 肺组织病理学观察 石蜡切片行HE染色，光镜观察.
　　1.2.4 RTPCR测定MMP9 mRNA的表达 Trizol试剂提取总RNA，分别将RNA 2 μL，随机六聚体1 μL，ddh3O 9 μL， MMLV反转录反应缓冲液4 μL， RNasin 1 μL， dNTPs 2 μL， MMLV 1 μL依次加入反应管中，按反转录试剂盒说明书进行反转录. 内参照引物和MMP9基因PCR扩增产物设计与合成:根据GenBank上发表的管家基因GAPDH和MMP9的序列，利用Primer Premier 5.0软件设计了可以扩增的引物：GAPDH上游引物为5′ CATCACTGCCACCCAGAAGA 3′，下游引物为5′ TGAAGTCGCAGGAGACAACC 3′，扩增片段长度为320 bp；MMP9基因上游引物为5′ GTGTGTTCCCGTTCATCTTT 3′，下游引物为5′ ATGCCGTCTAT GTCGTCTTT 3′，扩增片段长度为454 bp. 分别取反转录产物2 μL， 10×PCR反应缓冲液5 μL， dNTPs 1 μL，上下游引物各1.25 μL，Taq酶0.5 μL，加ddh3O补足至25 μL，在PCR扩增仪中进行反应，反应条件为94℃预变性4 min；95℃变性15 s；58.5℃退火1 min；72℃延伸2 min，35个循环. 同时，PCR扩增管家基因GAPDH作为检验反转录是否成功的标准. 各取5 μL PCR产物做10 g/L琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中观察.
　　统计学处理: 采用SPSS 11.0统计软件，数据以x±s表示，组间均数比较采用方差分析及LSDt检验，以P&<0.05为差异有统计学意义.
　　2 结果
　　2.1 慢性哮喘气道重塑模型 对照组行动敏捷，一般情况未见异常. 哮喘组经激发后，出现呼吸急促，口唇发绀，腹部翕动，易激惹，烦躁不安. 地塞米松干预组、银杏叶干预组也出现哮喘组情况，但症状明显减轻.
　　2.2 肺组织病理学改变 光镜下观察，与对照组相比，哮喘组小鼠气道壁及气道平滑肌明显增厚，黏膜下水肿，黏膜下层增宽，可见黏液栓堵塞，气道上皮细胞脱落，杯状细胞增多，黏膜下及管周有大量炎性细胞浸润，可见淋巴滤泡. 地塞米松干预组以及银杏叶干预组上述改变较哮喘组明显减小（图1）.
　　A: 对照组小鼠气道无明显增厚、内壁光滑，气道周围无炎性细胞浸润，肺泡壁结构完整; B: 哮喘组小鼠气道平滑肌层明显增厚，管壁周围大量炎性细胞浸润，肺泡有明显出血; C: 地塞米松干预组小鼠气道增厚明显减轻，管壁周围少量炎性细胞浸润; D: 银杏叶干预组气道壁增厚也见减轻，炎性细胞减少.
　　图1 各组小鼠肺组织石蜡切片 HE ×400
　　2.3 肺组织MMP9 mRNA表达 应用RTPCR对MMP9 mRNA水平表达量进行检测提示， 哮喘组MMP9 mRNA表达量高于正常对照组， 而地塞米松干预组表达量以及银杏叶干预组较哮喘组有降低(P&<0.05). 图2为4组小鼠肺组织MMP9 RTPCR电泳图. 在300 bp附近的条带为GAPDH，在400～500 bp之间的条带为MMP9 mRNA.
　　3 讨论
　　哮喘的基本特征为气道慢性炎症、气道高反应性以及气道重塑. 气道重塑是慢性哮喘的重要病理特征之一，已成为哮喘研究的热点，其主要表现为气道上皮下纤维化、基质改变以及气道平滑肌层肥厚等气道壁结构改变，是造成不可逆性气流受限的重要基础. 本试验参照文献成功制备了哮喘气道重塑模型，并观察了银杏叶提取物对气道重塑的预防作用.
　　M: DNA marker; 1: 地塞米松干预组; 2， 4， 6， 8: 管家基因GAPDH，3: 对照组; 5: 哮喘组; 7: 银杏叶干预组.

表1 各组小鼠肺组织MMP9 RTPCR吸光度比值细胞外基质(extralcellear memberma，ECM)的降解和沉积失衡是导致气道壁结构异常、肺实质破坏及间质增生的重要原因，而ECM主要由基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）来降解. MMPs是自然界进化中高度保守的一组锌离子(Zn2+)依赖性蛋白水解酶，其中MMP9与哮喘的关系最为密切，其作用底物为Ⅳ， Ⅴ， Ⅶ， Ⅹ型胶原、明胶、变性胶原、弹性蛋白. 正常稳态下肺组织中MMP9表达很少，而在炎性因子、激素、生长因子刺激下和细胞转化过程中其表达量增加［5］. 银杏叶是我国名贵中药材银杏的叶，其提取物的有效成分中24％为黄酮类，6％为内酯类. 黄酮类具有较强的抗氧化作用，而银杏内酯B是天然的PAF拮抗因子. 研究证实，Egb具有广泛的药理作用：抗血小板活化因子、清除自由基、抗炎、抗过敏等［6］. Ishii等［7］在小鼠哮喘模型研究中发现，PAF受体激活参与气道高反应性的形成，并不依赖于气道炎症，而Egb中银杏内酯B可以阻止PAF与其受体的结合［8］，从而降低气道高反应性. PAF可以可通过多种途经和方式引起哮喘，如增加气道高反应性，导致气管痉挛，引起气道炎症反应以及气道粘液栓形成等. Fukuyama等［9］发现豚鼠给予外源性PAF也可见气道高反应性. Henderson等［10］研究报道应用PAF拮抗剂重组人血小板活化因子乙酰氢化酶可有效抑制哮喘小鼠的气道炎症及高反应性. 结合本试验，与哮喘组相比银杏叶处理组小鼠气道壁厚度明显减轻，炎症反应也减轻，MMP9 mRNA也明显减少，提示MMP9在哮喘气道重塑中有重要作用，而PAF和MMP9之间似乎也存在某种联系. Ko等［11］研究认为在PAF引起的实验性肿瘤转移中，MMP9发挥了重要的作用，外源性PAF注入可引起MMP9表达的增加. 本试验发现银杏叶提取物抑制PAF的表达后，MMP9的表达也降低，表明二者之间可能存在某种联系，而具体联系机制还不得而知.
　　综上所述，银杏叶提取物干预可以降低气道重塑重要调节因子MMP9的表达，这一机制可能成为银杏叶防治哮喘的重要理论基础.
【

参考文献

】
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