关于犬颅脑枪弹伤后心肌细胞凋亡及bcl2的表达

【摘要】 目的: 研究犬脑枪弹伤后心肌细胞凋亡及bcl2的表达. 方法: 建立犬颅脑枪弹伤模型，制备心肌组织切片. 采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的生物素脱氧尿嘧啶核苷酸缺口末端标记法(TUNEL)检测心肌细胞凋亡以及用免疫组织化学方法检测bcl2的表达. 结果: 对照组偶见心肌细胞凋亡及bcl2的表达，枪弹伤后3 h凋亡心肌细胞及bcl2表达明显（P&<0.01）. 心室壁内侧凋亡细胞分布基本一致（P&>0.05），内外侧壁凋亡细胞分布不同（P&<0.01）. 心室壁内侧以及内外侧壁心肌细胞bcl2表达差异无统计学意义（P&>0.05）. 结论: 犬脑枪弹伤后可造成心肌细胞损害和bcl2表达.
【关键词】 脑 心肌 火器伤 细胞凋亡 bcl2
　　0引言
　　由于局部战争及恐怖暴力事件不断发生，火器伤的研究仍是目前军事医学研究的重点内容. 火器伤时，除了局部伤道及周围组织严重损伤外，也可导致远离伤道的多种器官和组织出现不同程度的损伤［1］. 为了探讨颅脑火器伤对心肌的影响，我们采用低速弹德国小口径步枪制作犬颅脑切线伤（Tangent brain injury，TBI）模型［2］ ，采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的生物素脱氧尿嘧啶核苷酸缺口末端标记法（terminal deoxynucleotidyl transfereasemediated biotinylated deoxyuridine triphosphate nick and labeling， TUNEL）检测心肌细胞凋亡，以免疫组织化学技术检测bcl2的表达，为临床救治火器伤提供理论依据.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　西安地区杂种犬10只，雌雄不拘，体质量（16.2±2.1）kg，随机分为正常对照组（n=5）和脑枪弹伤组（n=5）. 原位细胞凋亡检测试剂盒，兔抗人、大鼠和小鼠bcl2基因为第一抗体，链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物试剂盒等（均为湖北武汉博士德生物工程有限公司产品）.
　　1.2方法
　　1.2.1动物模型的建立
　　用30 g/L戊巴比妥钠（0.03 g/kg）静脉麻醉，气管插管后，固定于射击靶台上，前额眶上约2 cm固定于靶孔处，于睫毛反射恢复后，距25 m用德国小口径步枪弹（子弹弹径5.56 mm，质量2.57 g，撞击速度350 m/s， 致伤能量160.0 J）制作脑切线伤.
　　1.2.2样本制作
　　枪击后3 h开胸，主动脉插管，剪开右心房，灌注生理盐水流淡红色血液时，换40 g/L多聚甲醛磷酸缓冲液（phosphatebuffered saline solution， PBS， pH 7.4）灌注至右心房流出清亮液为止，取出心脏，中性多聚甲醛液固定24 h，取左右心室内外侧壁组织. 常规石腊包埋，切片厚5 μm，备凋亡检测及免疫组化用. 对照组除不施行枪弹射击外，其余操作同枪伤组.
　　1.2.3细胞凋亡及bcl2表达的检测
　　随机抽取不同分布区域每个动物标本2张并随机分为两组，一组用末端脱氧核糖核酸转移酶介导的生物素脱氧尿嘧啶核苷酸缺口末端标记法染色，另一组用兔抗人、大鼠和小鼠免疫组织化学测定. 采用链霉素亲和素生物素过氧化酶复合物法(streptavidinbiotin compiex， SABC)，小鼠抗人、大鼠和小鼠bcl2基因抗原为第一抗体，用已知阳性细胞为阳性对照，阴性对照用磷酸盐酸缓冲液（phosphatebuffered saline solution， PBS）代替一抗. 两种染色均参照试剂盒说明书进行. 应用Quantiment570C图像分析系统对阳性细胞测定，在放大200倍条件下，对每张凋亡和免疫组化染色切片随机测定10处单位面积（计算机系统提供窗口面积）内阳性细胞数占总心肌细胞数的百分比作为心肌细胞凋亡指数（AI）和bcl2的表达.
统计学处理: 各组实验数据用x±s表示，应用SPSS11.0软件，组内进行单因素方差分析，组间采用非参数秩和检验.
　　2结果
　　2.1组织病理学观察
　　肉眼观察枪伤组5例中有3例心室壁内侧可见散在点状出血，左心室较右心室多见，其余2例和对照组均未见出血点，心房及心外侧壁均未见异常. 苏木素伊红（HE）染色光镜观察发现：对照组心肌细胞染色清晰，形态完整，细胞质横纹清晰，细胞核致密呈椭圆形. 枪弹伤组心肌间质水肿，细胞纤维断裂，纤维间可见红细胞浸润，细胞核固缩、崩解，形态不规则.
　　2.2细胞凋亡及bcl2的表达
　　对照组犬心肌组织切片未见凋亡的心肌细胞的表达，枪弹伤3 h后凋亡心肌细胞表达明显，与对照组相比差异有统计学意义（P&<0.01）. 心室内侧壁凋亡细胞分布基本一致（P&>0.05），内外侧壁凋亡细胞分布不同（P&<0.01，表1)；对照组犬心肌组织切片偶见bcl2的表达，枪弹伤3 h后心肌细胞bcl2的表达明显，两组差别有统计学意义（P&<0.01），心室内侧壁以及内外侧壁心肌细胞bcl2表达差异无统计学意义（P&>0.05，表2).
　　3讨论
　　细胞凋亡发生机制极为复杂，迄今尚未完全阐明. 近年研究表明生物体内外多种因素可以诱发和调控细胞凋亡，现已发现调控凋亡过程的基因有促凋亡基因和抗凋亡基因两类. 目前普遍认为bcl2家族基因和ced家族基因是其中起重要作用的基因. 研究表明低氧或缺血可通过下调bcl2和/或上调bax的表达而引起细胞凋亡；在酸中毒条件下，更易产生细胞凋亡［3-4］.表1犬脑枪弹伤3 h后心肌细胞凋亡指数的比较(略)表2犬脑枪弹伤3 h后心肌细胞bcl2的表达(略) 　　近年来人们对心肌细胞的凋亡以及bcl2的表达进行了大量研究，认为早期心肌缺血以及缺血后再灌注均可引起细胞凋亡和bcl2的表达，且多在损伤后2~3 h开始表达［3-6］，根据这种变化，我们制作了颅脑火器伤动物模型，探讨其对心肌细胞的影响. 结果提示：颅脑火器伤可造成心肌细胞受损，组织病理学观察与舍俐等［7］报道的结果相比较轻，可能与建立的动物模型不同有关. 有人探讨不同能量弹丸致颅脑火器伤后生理病理研究发现，致伤能量愈大，生理指标变化愈明显［8］. 也有人认为枪弹伤致远隔脏器损伤发生机制复杂、多样，除致伤瞬间压力波的空腔效应产生间接损伤外，同时与投射物的速度、质量、致伤部位及个体差异有关［9］.
　　本实验研究发现不论枪弹伤组左右心室内侧有无出血点，心室壁内侧凋亡细胞和bcl2的表达均无显著差异（P&>0.05），而内外侧壁凋亡细胞分布不同（P&<0.01），bcl2的表达无差异（P&>0.05）. 我们认为颅脑火器伤造成心肌受损机制复杂，弹丸冲击波（压力波）对周围脑组织产生很大影响，可导致中枢性呼吸暂停，造成心肌细胞缺血缺氧，引起酸中毒可致细胞凋亡；同时火器伤后空腔效应对心血管管腔快速运动产生瞬间冲击力致使心肌受损［7］；而且损伤心血管中枢出现心率减慢，血压下降，随后血压上升和心率逐渐恢复，这种损伤可能与急性心肌缺血以及缺血后再灌注心肌受损具有类似的病理生理机制. 心室壁内外侧壁细胞凋亡不同（P&<0.01），可能与颅脑火器伤后空腔效应产生瞬间冲击力致使心肌受损，这种空腔效应使心室内血液对内侧壁的作用强于外侧壁而致，但这不能解释内外侧壁心肌细胞bcl2的表达结果，冯全洲等［10］在心肌缺血实验中发现bcl2的表达与细胞凋亡的表达区域不一致，认为bcl2表达可能并不直接参与缺血心肌细胞凋亡的调控. 故其原因以及它们的动态变化规律值得进一步探讨.

【参考文献】
　　［1］王正国.创伤弹道学研究的思考［J］.中华创伤杂志，2000， 16(3): 133-135.

　　［2］侯明山，章翔，费舟，等.犬颅脑枪弹伤后神经细胞凋亡及bcl2的表达［J］.中华神经外科疾病研究杂志，2004，3(3)： 242-244.

　　［3］董建文，朱卫中，周兆年.低氧与心肌细胞凋亡［J］.细胞生物学杂志，2004，26：462-466.

　　［4］何斌，王志农，曾志勇，等.缺血预适应对再灌注性心肌超微结构损伤和细胞凋亡的保护作用［J］.第二军医大学学报，2004， 25(4)： 374-378.

　　［5］胡丙杰，陈建国，徐小虎，等.早期心肌缺血心肌细胞凋亡的实验研究［J］.中国法医学杂志，2001，16(2):65-68.

　　［6］刘宗军，江智文，温沁竹.急性缺血诱导大鼠心肌细胞凋亡的时间演变和空间分布［J］.中国心血管病研究杂志，2004，2(11):905-908.

　　［7］舍俐，徐如祥，朱红胜，等.高温高湿环境下颅脑火器伤对狗心肌损害的作用［J］.中华神经医学杂志，2004，3（1）：51-53.

　　［8］刘伟国， 段国升，罗毅，等.不同能量弹丸致颅脑伤后生理病理研究［J］.中华神经外科杂志，1998，14(1):19-22.

　　［9］邓旦，李树森，廖明松，等.肢体枪弹伤致心脏间接损伤后心功能改变的超声研究［J］.心脏杂志，2002，14（6）：504-508.

　　［10］冯全洲，韦立新，易军，等.大鼠实验性心肌缺血后的表达与心肌细胞细胞凋亡的关系［J］.中华病理学杂志，2004，33（2）： 151-154.