关于替代性活化的巨噬细胞促进淋巴管内皮细胞增殖的机制

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【摘要】 目的： 观察替代性活化的巨噬细胞(aaMphi)对淋巴管内皮细胞(LEC)增殖的影响机制. 方法： 以重组小鼠IL4处理小鼠RAW264.7巨噬细胞24 h，建立aaMphi模型. 采用Transwell系统共培养aaMphi和小鼠LEC，台盼蓝拒染法绘制LEC生长曲线，3HTdR掺入法观察LEC增殖状况，实时定量RTPCR法分别检测共培养前后血管内皮生长因子(VEGF)C，VEGFD mRNA在aaMphi中的表达，以及VEGFR3，Prox1 mRNA在LEC中的表达. 结果： 与aaMphi共培养后，LEC生长速度加快，增殖指数(PI)高于其他对照组. 与共培养前比较，aaMphi表达VEGFC mRNA增加(P&<0.01)，但表达VEGFD mRNA无统计学变化(P&>0.05)；LEC表达VEGFR3和Prox1 mRNA均增加(P&<0.01， P&<0.05). 结论： aaMphi能促进LEC增殖; aaMphi表达VEGFC mRNA和LEC表达VEGFR3， Prox1 mRNA增加是其作用机制之一.
【关键词】 巨噬细胞 替代性活化 淋巴管 内皮细胞 细胞增殖 淋巴管生成
　　0引言
　　
　　巨噬细胞在不同的环境中，可以发生不同性质的活化，成为具有不同表型和功能特征的亚群［1］，如经典活化的巨噬细胞(classically activated macrophages， caMphi)，替代性活化的巨噬细胞(alternatively activated macrophages， aaMphi)和Ⅱ型活化的巨噬细胞. 近年研究表明，巨噬细胞参与了炎症条件下或肿瘤组织中的淋巴管生成(lymphangiogenesis)，但其活化表型及作用机制尚不明确［2］. 淋巴管生成的基本过程包括淋巴管内皮细胞(lymphatic endothelial cells， LEC)增殖、迁移和管样结构形成等. 我们观察与aaMphi共培养后LEC的增殖状况，并检测共培养前后血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)C，VEGFD在aaMphi中的表达以及VEGFR3，转录因子Prox1在LEC中的表达情况，为明确aaMphi在淋巴管生成中的作用提供实验依据.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　小鼠RAW264.7巨噬细胞株(以下简称RAW264.7细胞)购自美国典型细胞中心. 高糖DMEM培养基、低内毒素胎牛血清(FBS)购自美国Hyclone公司. 含多种生长因子的EBM2培养基购自美国Cambrex公司. 重组小鼠IFNγ和IL4购自美国Cytolab公司. LPS购自美国Sigma公司. 3HTdR购自北京原子能研究所. Tripure购于德国Roche公司. RTPCR试剂盒购于日本TaKaRa公司. 荧光染料SYBR Green1购自上海GeneRay公司. 小鼠VEGFC，VEGFD，VEGFR3，Prox1和βactin引物由上海生工公司合成(表1). 表1小鼠PCR引物核酸序列（略）
　　1.2方法
　　小鼠LEC的分离、培养和鉴定见参考文献［3］. 参考Edwards等［1］的方法，取对数生长期的RAW264.7细胞以2 × 105/孔接种于6孔培养板中. 待细胞贴壁后，分别以IFNγ (终浓度100 kU/L)＋LPS (终浓度10 μg/L)， IL4 (终浓度10 kU/L)处理，24 h后即可建立起caMphi和aaMphi的模型. 选择孔径为0.4 μm的上室和24孔培养板(下室)建立起Transwell共培养系统(0.4 μm的微孔滤膜可以保证培养液和细胞因子能上下相通，而装置内外的细胞被隔开). 其中，24孔培养板预先用自制的鼠尾胶包被. 首先在下室内接种0.5 mL(含细胞1×105个)处于对数生长期的LEC，24 h后在上室内接种aaMphi 0.5 mL(含细胞1×105个)，然后共培养. 根据上室内的细胞类型分为 ① 空白对照组：未接种任何细胞；② caMphi组：接种caMphi；③ aaMphi组：接种aaMphi；④ RAW264.7组：接种未经处理的RAW264.7细胞. 上述各组分别设6个时间点平行孔，每个时间点又设3个复孔. 每隔24 h，连续6 d分别对下室LEC进行台盼蓝染色. 计算每个时间点的平均活细胞数. 以培养时间为横坐标、平均细胞数为纵坐标绘制LEC生长曲线.
　　1.2.13HTdR掺入法
　　观察LEC增殖状况于实验前晚将LEC半量换液，实验时取1×106个细胞，以不含FBS的培养液洗涤3次，最后将细胞悬浮于0.5 mL完全培养液中；加3HTdR 3.7×105 Bq，放入孵箱孵育3 h，每30 min轻摇1次；标记结束时加FBS数滴，洗去游离同位素，加完全培养液洗浴30 min，调整细胞浓度2×108/L备用. 将aaMphi (另设空白对照组、caMphi组及RAW264.7组， 浓度均为1×109/L)及LEC各0.5 mL (5∶1)加入Transwell共培养系统(孔径为0.4 μm)的上室和下室中，在孵箱中作用20 h后，多功能低温离心机低速离心5 min收集下室的LEC；加混合酶(8 mg/L胰酶与0.5 mg/L DNA酶对倍稀释而成)1 mL，作用30 min后，用多头细胞收集仪收集细胞于玻璃纤维滤纸上，烘干后放入闪烁杯送检Bq，代表3HTdR的掺入量，反映LEC的增殖状况. 每组设3个复孔，取其平均值计算. 增殖指数(proliferation index， PI)的计算：PI=共培养组的Bq/空白对照组的Bq.
　　1.2.2实时定量
　　RTPCR共培养aaMphi和LEC，分别收集共培养前后的LEC各4×106个，用Tripure提取总RNA. cDNA合成按RTPCR说明书操作，随后进行定量PCR检测. 20 μL反应体系中含有：2×PCR Buffer 10 μL，2.5 mmol/L dNTP mix 1 μL，25 mmol/L MgCl2 2 μL，40×SYBR Green I 0.5 μL，10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，Ex Taq酶0.5 μL，ddh3O 4 μL. 扩增条件为：94℃ 3 min；94℃ 20 s，52℃ 20 s，72℃ 15 s，共28个循环；最后72℃延伸3 min. 扩增完毕后进行溶解曲线分析. 同时对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析其特异性. 采用样点拟合法分析结果，求每个样本的Ct值. 以βactin mRNA作为内参照，计算目的基因mRNA的相对含量. 计算公式：目的基因mRNA/βactin mRNA＝2CtACtB(其中CtA为βactin的Ct值，CtB为目的基因的Ct值). 每组3个样本.
　　统计学处理： 计量资料用x±s表示，采用SPSS 13.0统计软件包进行分析，组内比较采用随即区组方差分析，组间比较采用单因素方差分析及LSDt检验. P&<0.05表示差异具有统计学意义.
　　2结果
　　
　　aaMphi组LEC增殖速度较快，高于其他3组；而caMphi组和RAW264.7组在第4日开始进入生长平台期. 此结果表明，aaMphi能够明显促进LEC增殖，而caMphi和RAW264.7细胞则抑制其增殖(图1).
　　2.13HTdR掺入法
　　观察LEC增殖状况caMphi组、aaMphi组和RAW264.7组LEC的PI值分别为0.79±0.08，1.87±0.43和0.88±0.29. aaMphi组与caMphi组、RAW264.7组之间均存在统计学差异(P&<0.01， P&<0.01)，RAW264.7组与caMphi组之间无统计学差异(P&>0.05). 说明aaMphi能够促进LEC增殖，而caMphi和RAW264.7细胞则抑制其增殖.
　　2.2实时定量RTPCR检测与共培养前比较，aaMphi表达VEGFC mRNA增加(P&<0.01，表2)，但表达VEGFD mRNA无统计学变化(P&>0.05)；LEC表达VEGFR3和Prox1 mRNA均增加(P&<0.01， P&<0.05). 表2共培养前后不同细胞分别表达mRNA的情况(略)

　　3讨论
　　
　　活化的巨噬细胞可执行不同免疫功能［4］. 近年研究表明，巨噬细胞不仅参与了炎症条件下的淋巴管生成，而且与肿瘤诱导的淋巴管生成等密切相关. Maruyama等［5］发现小鼠角膜移植后，来源于骨髓的CD11b+巨噬细胞聚集于角膜基质中，能单独形成淋巴管样结构，促进角膜淋巴管生成. 在慢性气道炎症中，Baluk等［6］发现巨噬细胞能表达VEGFC和VEGFD，从而参与了淋巴管生成. 我们前期研究发现，肿瘤相关巨噬细胞(tumorassociated macrophages， TAM)能够诱导肺腺癌VEGFC表达和淋巴管生成，可能进而促进了淋巴结转移. 目前，在诱导炎症组织淋巴管生成的过程中，巨噬细胞的活化表型尚未明确. 但是在肿瘤组织中，TAM可能发生替代性活化，呈现出aaMphi的表型，参与肿瘤的生长、进展和转移［7］. Hagemann等［8］研究表明，与卵巢癌细胞接触共培养的巨噬细胞可以朝着与癌细胞相似的表型转化. 我们前期研究已经证实，肺腺癌TAM的确呈现出替代性活化的表型.
　　
　　VEGFC和VEGFD是迄今为止发现的最重要的淋巴管生成因子. 肿瘤细胞或巨噬细胞分泌的VEGFC和VEGFD均可与其受体VEGFR3结合，通过促进LEC增殖、迁移和管样结构形成等方式介导肿瘤淋巴管生成［9］. Prox1是一种同源框基因转录因子，在多种细胞中均有表达，但在内皮细胞中，仅特异性地表达于胚胎、成人和肿瘤组织中的LEC，是淋巴管生成调控机制中的关键因子. 本研究我们发现，aaMphi(而非caMphi)能够明显促进LEC增殖，此结论不仅把巨噬细胞和淋巴管生成的关系推进到了亚群水平，而且也印证了我们的前期研究. 此外，我们运用实时定量RTPCR法发现，aaMphi表达VEGFC(而非VEGFD)和LEC表达VEGFR3，Prox1 mRNA增加是aaMphi促进LEC增殖的分子机制之一.

【

参考文献

】
　　［1］Edwards JP， Zhang X， Frauwirth KA， et al. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations ［J］. J Leukoc Biol， 2006，80(6):1298-1307.

　　［2］Kerjaschki D. The crucial role of macrophages in lymphangiogenesis［J］. J Clin Invest， 2005， 115(9): 2316-2319.

　　［3］章必成， 王俊， 赵勇， 等. 以鼠尾胶为贴黏剂的小鼠淋巴管内皮细胞培养体系的建立［J］. 第四军医大学学报， 2007，28(5): 390-393.

　　［4］Raes G， Brys L， Dahal BK， et al. Macrophage galactosetype Ctype lectins as novel markers for alternatively activated macrophages elicited by parasitic infections and allergic airway inflammation［J］. J Leukoc Biol， 2004， 77(3): 321-327.

　　［5］Maruyama K， Ii M， Cursiefen C， et al. Inflammationinduced lymphangiogenesis in the cornea arises from CD11bpositive macrophages［J］. J Clin Invest， 2005， 115(9): 2363-2372.

　　［6］Baluk P， Tammela T， Ator E， et al. Pathogenesis of persistent lymphatic vessel hyperplasia in chronic airway inflammation［J］. J Clin Invest， 2005，115(2):247-257.

　　［7］Sica A， Schioppa T， Mantovani A， et al. Tumourassociated macrophages are a distinct M2 polarised population promoting tumour progression: Potential targets of anticancer therapy［J］. Eur J Cancer， 2006， 42(6): 717-727.

　　［8］Hagemann T， Wilson J， Burke F， et al. Ovarian cancer cells polarize macrophages toward a tumorassociated phenotype［J］. J Immunol， 2006， 176(8): 5023-5032.

　　［9］Alitalo K， Tammela T， Petrova TV. Lymphangiogenesis in development and human disease［J］. Nature， 2005， 438(7070): 946-953.