作者：杜舟，黄萍，程骏，刘纳新
【摘要】 目的 ：探讨p53和Rb蛋白在不同组织学分型胃癌中的表达及意义。方法：采用免疫组化SP二步法检测216例胃癌术后原发灶标本和80例癌旁正常的胃黏膜组织标本中p53及Rb蛋白的表达情况。胃癌标本按组织学特点分为：高分化腺癌、中分化腺癌、低分化腺癌、黏液腺癌、印戒细胞癌、未分化癌五型。结果：①正常胃黏膜和胃癌标本中p53的阳性表达率分别为0、67.10%(P &<0.01);Rb的阳性表达率分别为100%、51.85%(P &<0.01)。②不同组织学分型的胃癌中，癌细胞分化程度越好，p53的阳性表达率越低(P &<0.05)，Rb的阳性表达率也越高(P &<0.05)。③在胃癌中p53和Rb的蛋白表达无相关性(P &>0.05)。结论：p53蛋白 及Rb蛋白阳性表达在不同组织学分型的胃癌中差异呈显著性;胃癌细胞分化程度越差，p53的阳性表达率越高，Rb的阳性表达率越低，但两者并无关联性。
【关键词】 胃肿瘤;p53;Rb;免疫组化;组织学分型;细胞分化
Abstract: Objective: To explore the expression of p53 and Rb protein in gastric neoplasms with different histological types and their significance. Methods: Two hundred and sixteen cases of gastric neoplasms specimens and 80 normal adjacent gastric mucosal tissues were collected. The expression of p53 and Rb was examined with immunohistochemical staining (SP method). Accordingto the histological types， gastric neoplasms specimens were pided into five groups: well-differen-tiated adenocarcinoma，moderate-differentiated adenocarcinoma，poor-differentiatedadenocarcinoma，muci-nous adenocarcinoma and signet-ring cell carcinoma and anaplastic carcinoma.Results: ①P53 was no expression in normal gastric mucosa，and was 67.10% in gastric neoplasms(P &<0.01). The positive rate of Rb was 100% in normal gastric mucosa，and was 51.85% in gastricneoplasms (P &<0.01). ②The expression of p53 was negatively related to the differentiation indifferent histological types of gastric neoplasms (P &<0.05)， but the expression of Rb waspositively related to that (P &<0.05). ③The expression of p53 was not correlated with Rb in gastricneoplasms (P &>0.05). Conclusion: The positive expression of p53 and Rb in gastric neoplasms withdifferent histologi-cal types offers significant difference. The cytodifferentiation of gastricneoplasms is poorer，the positive rate of p53 is higher and the positive rate of Rb is lower. The suppressor gene p53 is not correlated with Rb in the course.
Key words: gastric neoplasms;p53;Rb;immunohistochemistry;histological type;cytodifferentiation
胃癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，发生机制较为复杂，涉及一系列遗传学改变， 现有研究表明其发生、发展与抑癌基因的突变、失活或缺失有关[1]。p53、Rb是重要的抑癌 基因，它们的表达异常会导致癌瘤的生成与发展[2]。有报道称，p53基因的失活在胃癌发生、发展过程中起了关键作用[3]。Rb蛋白表达能够反映胃癌的进展程度，可以作为胃癌判断预后的指标[4]。因此，从分子或蛋白水平上寻找与肿瘤发生发展有关的标志物，有助于胃癌的诊断。本研究通过免疫组织化学技术检测p53、Rb蛋白在五种不同分型胃癌和正常胃黏膜组织中的表达情况，探讨其在不同组织学分型胃癌发生、发展中的意义。
1 材料和方法
1.1 材料
标本取自温州医学院附属第一医院2004年7月-2008年2月手术治疗初诊为胃癌的216例病例标本(胃癌组)，男144例，女72例;年龄27～89岁，平均(60.68±7.27)岁。伴有周围淋巴结转移145例，无淋巴结转移71例。经病理组织学证实癌旁5 cm外正常的胃黏膜组织标本80例(正常胃黏膜组织组)，其中男59例，女21例，年龄30～75岁，平均(55.30±8.45)岁。所有研究对象受检前均未经放疗、化疗等治疗。按UICC 2002年TNM分类和分期法对本组胃癌病例进行分期，I期39例，II期44例，III期101例，IV期32例。标本经10%的福尔马林固定，石蜡包埋，连续切取厚4μm切片，60 ℃烤片1 h，37 ℃过夜备用。
1.2 方法
采用SP二步法进行免疫组化染色，组织切片脱腊至水;用3%的h3O2去离子水孵育10 min，阻断内源性过氧化物酶;根据所应用的一抗的特殊要求，分别进行高压和微波的抗原修复;冷却至室温，滴加一抗，在4 ℃冰箱中过夜;滴加通用型二抗IgG璈RP多聚体，37 ℃烘箱中孵育10 min;二氨基联苯胺(DAB)显色，水洗;苏木素复染、脱水、封片。阴性对照用PBS代替一抗，用已知的阳性片作阳性对照，显微镜观察。p53、Rb鼠抗人单克隆抗体和通用型二抗、DAB显色剂均购自北京中杉公司(进口分装，即用型)。
1.3 判断标准
p53、Rb阳性定位于细胞核。根据肿瘤阳性细胞数将其分为4级：≤10%，11%～50%，51%～75%，&>75%;再根据染色强度打分：0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色(染色深浅需与背景着色相对比)，两者乘积&>3分为阳性。同时，根据胃癌在显微镜下的组织学特点，参照WHO胃癌分类标准将其分为五型：高分化腺癌、中分化腺癌、低分化腺癌、黏液腺癌和印戒细胞癌、未分化癌。
1.4 统计学处理方法
采用x2检验。
2 结果
2.1 p53 、Rb 蛋白在胃癌组织中的表达
胃癌组p53蛋白的阳性表达率显著高于正常胃黏膜组(P&<0.01)，而Rb蛋白的阳性表达率显著低于正常胃黏膜组(P&<0.01)。见表1。
2.2 不同组织学分型胃癌中p53、Rb蛋白的阳性表达
p53和Rb都以细胞核呈棕黄(褐)色颗粒为阳性，未见棕黄(褐)色颗粒为阴性。见图1、2。随着病理分化程度的进展及病理组织学分型恶性程度的增高，分别表现为p53蛋白表达升高和Rb蛋白的阳性表达率降低，各型胃癌的p53、Rb的阳性表达率差异均有显著性(P &<0.05)。见表2。
2.3 p53、Rb蛋白在胃癌中表达的相关性
p53、Rb均为抑癌基因，两者蛋白在胃癌中均有不同程度的表达，其表达情况如下：p53阳性组145例中Rb阳性72例，Rb阴性73例;Rb阳性组112例中p53阳性72例，p53阴性40例。经x2检验，连续性校正，x2=0.59，P&>0.05。
3 讨论
p53基因是目前研究最系统的抑癌基因之一，据报道大约在60%的人类肿瘤中，发现有p53基因的突变和缺失。野生型p53蛋白在正常细胞中几乎检测不到，而突变型p53稳定性增加，导致细胞无控制性生长，最终发展成恶性肿瘤，免疫组织化学技术所测的p53即为突变型，是胃肠肿瘤预后差的标志[3]。Tohdo等[5]认为p53基因突变与原发性胃癌的发生有关，是胃癌发生过程中的早期事件。本实验结果提示，p53蛋白在胃癌组织中阳性表达率为67.10%，随着病理分化程度的进展，p53蛋白表达升高，差异有显著性(P &<0.05)，而在正常的胃黏膜组织中没有表达，提示p53蛋白异常表达与胃癌的发生密切相关，检测异常的p53蛋白可能作为鉴别正常胃组织和胃癌组织的常规方法[6]。结果还提示，p53蛋白的阳性表达率在低中分化及黏液腺癌、印戒细胞癌明显高于高分化腺癌，提示p53基因突变可能是胃癌发生发展的一个重要环节，检测p53蛋白表达在判断胃癌恶性程度和预后方面有辅助作用。
Rb基因是最先在视网膜母细胞瘤中发现的一类抗癌基因。Rb蛋白在G0及G1期细胞内主要以非磷酸化的活性形式存在并与多种细胞蛋白结合，从而抑制其活化转录功能，因而具有G1期阻滞作用。当Rb基因发生缺失与重排时，G1期阻滞作用减弱，使细胞过度增殖，导致肿瘤的发生[7]。本组实验检测了216例胃癌病例与80例正常胃黏膜组织中的Rb蛋白，其阳性率分别为51.85%和100%，二者差异有显著性(P &<0.01)，提示Rb基因的表达缺失和突变可能与胃癌的发生、发展有关。实验结果还显示，随着病理组织学分型恶性程度的增高，Rb蛋白的阳性表达降低，低分化腺癌、黏液腺癌及未分化癌中的Rb蛋白表达低于高、中分化腺癌(P &<0.05)，表明抑癌基因Rb的表达程度同癌细胞的分化程度有关，癌细胞分化越好，Rb 阳性表达率越高，提示Rb蛋白的低表达在胃癌向不同分化方向发展方面可能起重要作用。Cordon等[8]研究认为p53和Rb相互协同，共同影响细胞的增生状况和癌变。Mattar等[9]研究提示，p53蛋白异常在由高分化向低分化发展的不同组织学类型胃癌中起关键作用，而Rb基因失活在胃癌中不起重要作用，并且提示p53及Rb基因在胃癌的发生发展中无相关性，没有协同作用。我们的实验结果显示，216例胃癌中，p53及Rb基因同时阳性表达有72例，同时2个基因均不表达有32例，同时表达p53阳性而Rb阴性有73例，同时表达p53阴性而Rb阳性有40例，差异无显著性(P &>0.05)，说明p53、Rb基因在胃癌发生发展中的作用是相互独立的，二者没有关联性。目前也鲜有文献报道p53、Rb基因在胃癌发生发展中具有相关性，对于两者是否与其他抑癌基因共同参与了胃癌的发生发展尚有待于进一步研究
参考文献
[1] Tahara E. Genetic pathways of two types of gastriccancer[J]. IARC Sci Publ， 2004(157): 327-349.
[2] 曾益新.肿瘤学[M]. 北京:人民卫生出版社， 1999:42-45.
[3] 杨晶，刘丽娜，吕申. TGF-β1、PTEN、p53在胃癌组织中的表达及意义[J]. 中国自然医学杂志， 2009 ，11(3):199-201.
[4] He XS， Rong YH， Su Q， et al. Expression of p16 gene and Rbprotein in gastric carcinoma and their clinicopathologicalsignificance[J].World J Gastroenterol，2005，11(15):2218-2223.
[5] Tohdo H， Yokozaki H， Haruma K， et al. p53 gene mutationsin gastric adenomas[J]. Virchows Arch B Cell Pathol InclMol Pathol，1993，63(3):191-195.
[6] Blok P，Craanen ME， Dekker W，et al. No evidence for func-tional inactivation of wild-type p53 protein by MDM2overexpression in gastric carcinogenesis[J]. J Pathol，1998，186(1):36-40.
[7] Yamasaki L. Role of the RB tumor suppressor in cancer[J].Cancer Treat Res，2003，115(9):209-239.
[8] Cordon-Cardo C. p53 and RB: simple interesting correlatesor tumor markers of critical predictive nature[J]. J ClinOncol，2004，22(6):975-977.
[9] Mattar R， Nonogaki S， Silva C， et al. P53 and Rb tumorsuppressor gene alterations in gastric cancer[J]. Rev HospClin Fac Med Sao Paulo，2004，59(4):172-180.