作者：田丽莉，董建勇，黄长江
【摘要】 目的 ：研究莪术醇对斑马鱼胚胎发育的影响。方法：以孵育6 h的斑马鱼胚胎为实验模型，设空白对照组和莪术醇组，观察记录发育畸形、孵化率、心率、自主运动次数及仔鱼的泳速。结果：莪术醇可致斑马鱼身体弯曲，EC50(96 h)为51.17 mg·L-1;能明显降低胚胎孵化率(P&<0.05);使心率显著降低(P&<0.05)，且呈剂量依赖性。低浓度莪术醇可显著促进斑马鱼自主运动(P&<0.01);能明显减小仔鱼的泳速(P&<0.05)。结论：莪术醇对斑马鱼胚胎的发育有一定影响。
【关键词】 莪术醇;斑马鱼胚胎;畸形;孵化率;心率;自主运动;泳速
Abstract: Objective: To study the developmental effects of Curcumol on embryo-larval zebrafish. Methods: The 6 h post-fertilization zebrafish was randomly pided into control group and different concentration of the Curcumol groups based on concrete experiment，then non-lethal malformation，hatching rate，heart beat，spontaneous movement and swimming velocity were observed and recordedin detail at specified stages. Results: The abnormality of zebrafish was observed with EC50 (96h) 51.17 mg·L-1 for curved body axis;Curcumol made hatching rate lower(P&<0.05)，heart beatdecreased(P&<0.05)in concentration-dependent way. The low concentration Curcumol could stimulatespontane-ous movement(P&<0.01)and reduce the swimming velocity compared to the control group.Conclusion: Curcumol is developmentally toxic effect on zebrafish in early life stage.
Key words: Curcumol;zebrafish;malformation;hatching rate;heart beat;spontaneous movement;swimming velocity
莪术醇是莪术油主要有效成分之一[1]。《中国药典》(2005年版)规定莪术醇为临床抗病毒、抗肿瘤用药莪术油质量控制的指标成分。莪术醇在体外能抑制金黄色葡萄球菌、β溶血性链球菌、大肠杆菌、伤寒杆菌的生长[2];对呼吸道合胞病毒有直接抑制作用，对流感病毒A和A3型有直接灭活作用[3-4]。莪术醇也是一种有发展前途的抗肿瘤药物[5]，可通过与半胱天冬蛋白酶无关的线粒体途径诱导人肺腺瘤(ASTC-a-1)细胞凋亡[6]。但莪术醇毒理学的研 究鲜见系统文献报道。近年来，斑马鱼生物模式愈多地应用于药物毒性评价[7]。本实验以斑马鱼胚胎为模型，研究莪术醇对斑马鱼胚胎的发育毒性，为临床安全用药提供初步研究资料。
1 材料和方法
1.1 动物
无病原体AB品系斑马鱼，由温州医学院水域科学与环境生态研究所提供。斑马鱼饲养于全封闭循环系统，养殖和繁殖均参照Zebrafish Book标准，鱼房内光照/黑暗比为14/10，室内温度26 ℃，水温28 ℃，pH 6.8～7.5，电导率850～900，其各项水质指标均合要求。取健康性成熟的斑马鱼，雌雄交配繁殖获得受精卵。将受精卵收集清洗后移入培养皿，在光照/黑暗比为14/10、28 ℃的人工气候箱内孵育至6 h。
1.2 试药与仪器
莪术醇由本实验室从莪术油中分离得到，经气相色谱鉴定纯度为99.2%;二甲基亚砜(分析纯、批号0902106、上海展云化工有限公司);Rxz 智能型人工气候箱(宁波市科技园区新江南仪器有限公司);Nikon Eelipsete2000倒置显微镜(日本尼康公司);PB0105J运动测试仪(法国View Point公司)。
1.3 方法
1.3.1 溶液配制：斑马鱼胚胎培养液参照Zebrafish Book标准：0.137 mol·L-1 NaCl、5.4mmol·L-1 KCl、0.25 mmol·L-1 Na2HPO4、0.44 mmol·L-1 K2HPO4、1.3 mmol·L-1 CaCl2、1.0mmol·L-1 MgSO4、4.2 mmol·L-1 NaHCO3;莪术醇用DMSO助溶配制母液，实验前用斑马鱼胚胎培养液稀释获得工作液，DMSO终浓度小于0.1%[8]。根据预实验设空白对照组(胚胎培养液)和不同浓度试药组。
1.3.2 斑马鱼胚胎畸形和孵化率测定：设空白对照组和莪术醇试药组(2 mg·L-1、10 mg·L-1、20 mg·L-1、40 mg·L-1)。取96孔板，按实验不同分组，每孔加入200μL工作液，将孵育6 h的健康胚胎随机放入各孔中，每孔1枚，每组30枚。于人工气候箱中继续孵育至96 h。在显 微镜下观察记录各组胚胎的孵化和畸形。
1.3.3 斑马鱼自主运动和心率测定：设空白对照组和莪术醇试药组(2 mg·L-1、10 mg·L-1、20 mg·L-1、40 mg·L-1)。取6孔板，按实验不同分组，每孔加入5 mL工作液，将孵育6 h 的健康胚胎随机放入各孔中，每孔10枚，即每组10枚胚胎。于人工气候箱中继续孵育至24 h，在显微镜下观察各组胚胎20 s内自主运动，以斑马鱼尾部摆动为准，尾部摆动一次即计数一次，并用软件NIS-Elements F 2.30录像记录;分别在胚胎孵育36、48、52、60和72 h时， 在显微镜下用计时器计数各组胚胎在10 s内的心跳次数。
1.3.4 斑马鱼孵化后仔鱼的运动行为测定：设空白对照组和莪术醇试药组(0.1 mg·L-1、1 mg·L-1、10 mg·L-1)。取96孔板，按实验不同分组，每孔加入200μL工作液，将孵育6 h的健康胚胎随机放入各孔中，每孔1枚，每组10枚，于人工气候箱中继续孵育至96 h。分别转移出各组孵化的仔鱼，用胚胎培养液润洗后置预先加有2 mL胚胎培养液的24孔板中，每孔1个，每组10个。继续在人工气候箱中至120 h。用斑马鱼行为分析系统，在正常光照(连续光照)和光刺激(光照和黑暗交替)下，通过View Point Application Manager软件记录并分析斑马鱼的运动速度。
1.4 统计学处理方法
组间比较采用t检验。
2 结果
2.1 莪术醇对斑马鱼胚胎发育畸形和孵化率的影响
莪术醇可导致斑马鱼胚胎发育畸形，表现为孵化后身体弯曲，其EC50(96 h)为51.17 mg·L-1;高浓度组(40 mg·L-1)孵化率明显降低，与空白对照组相比差异有显著性(P&<0.05)，其余组无明显影响。结果见图1-2。
2.2 莪术醇对斑马鱼自主运动的影响
低浓度试药组(2 mg·L-1、10 mg·L-1)自主运动次数显著增多，与空白组相比差异有显著性(P&<0.01)。但随着试药浓度升高效应下降，试药组40 mg·L-1自主运动次数为0。结果见图3。
2.3 莪术醇对斑马鱼心率的影响
从斑马鱼胚胎孵育36 h到72 h，各试药组心率与空白对照组相比均下降。在52 h时，与空白组相比差异均有显著性(P&<0.01)。结果见图4。
2.4 莪术醇对斑马鱼仔鱼运动行为的影响
在正常光照和光刺激下，试药组0.1 mg·L-1斑马鱼运动明显减小，与空白对照组相比差异有显著性(P&<0.05)，其他试药组与空白对照组相比差异无显著性(P&>0.05)。结果见图5-6。
3 讨论
斑马鱼属脊椎动物，是较好的活体研究体系，可保留药物代谢动力学过程;且繁殖发育能力强，胚胎在体外1 d的发育程度相当于人类胚胎3个月的发育，能为药物研究提供大量的 样本和较短的试验周期;胚胎透明，在显微镜下可清晰地看到血液循环、心脏跳动等心血管 功能及发育情况[9];幼体对光反应强烈，在行为学实验方面广泛应用[10]。因此斑马鱼生物模式便于检测分析中药的活性和毒性[7]。本实验以斑马鱼胚胎为模型，研究了莪术醇对其发育形态、孵化率、心率、自主运动和泳速的影响。结果表明，莪术醇可导致斑马鱼畸形，EC50(96 h)为51.17 mg·L-1，且高浓度试药能显著降低胚胎孵化率。《中国药典》(2005年版)中规定莪术为妊娠禁用药。据文献报道，0.2%莪术醇药剂可使怀孕雌鼠胎仔发育畸形[11]。但莪术醇对胚胎致畸的作用机制有待于深入研究。斑马鱼心脏的发育是一个复杂的过程，需要细胞增殖、迁移、分化和不同起源的细胞之间的相互作用，与多种基因的表达与调控有关。心脏是胚胎发育过程中最早发生并发挥功能的器官，完善的循环功能对于胚胎的正常发育起着关键作用。心率是体现心脏功能的一个重要指标，胚胎发育48 h后趋于稳定。本实验发现，莪术醇能导致斑马鱼胚胎心率明显降低，且呈剂量依赖性。但未见心脏组织形态的异常。斑马鱼在不同光照下的运动速度变化，直观地反映了身体各功能间的协调能力，是一种 简单有效地分析神经整合功能的方法[10]。斑马鱼发育初期的神经元称为原代神经元，是简 单神经系统的一部分，胚胎受精24 h后，这些原代神经元开始分行;48 h后，斑马鱼脑室形 成。当生物体暴露在环境物质中，引起神经系统正常行为改变时，即产生了神经毒性。研究 表明，化合物诱导下斑马鱼的神经细胞损害类似于在哺乳动物上观察到的结果[12]。本实验 结果显示，莪术醇可影响斑马鱼的自主运动：低浓度促进，高浓度则抑制;能降低仔鱼泳速。结合莪术醇导致斑马鱼的身体弯曲分析，推测莪术醇对斑马鱼神经系统的发育有一定影响，其作用机制有待进一步研究。
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