作者：赵玉杰，陈栎江，周翠，周铁丽，郭美艳，曹建明
【摘要】 目的 ：了解临床分离鲍曼不动杆菌的耐药性和β-内酰胺酶基因分布情况。方法：采用VITEK-60全自动细菌分析仪对215株鲍曼不动杆菌临床分离株进行药敏检测，并通过特异性的PCR和DNA序列测定方法检测试验菌的β-内酰胺酶相关基因。结果：鲍曼不动杆菌对酶抑制剂复合制剂头孢哌酮/舒巴坦的敏感率最高，为54.1%，对亚胺培南、美洛培南的敏感率分别为46.4%、39.3%，对其他药物的敏感率均很低，对三代头孢的敏感率均低于20%;215株鲍曼不动杆菌中，27株扩增到超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)基因，占12.6%，包括TEM 16株，占7.4%，SHV 4株，占1.9%，CTX-M-1 4株，占1.9%， OXAⅡ3株，占1.4%，经测序分型分别为TEM-1型、SHV-1型、OXA-21型、CTX-M-15型和CTX-M-22型，未检测到VEB、GES、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9、TLA、IBC、OXA-10、OXAⅠ、OXAⅢ、OXAⅣ、OXAⅤ等基因。129株扩增到头孢菌素酶(AmpC)基因，占60.0%，其中ADC阳性82株，占38.1%，DHA、EBC、ACC、CIT基因阳性株分别为35株(占16.3%)、8株(占3.7%)、3株(占1.4%)和1株(占0.5%)，未检测到MOX、FOX、CARB基因;215株菌株中检出OXA-23阳性98株，占45.6%。结论：临床分离鲍曼不动杆菌耐药严重，其携带TEM、ADC、DHA、OXA-23等多种β-内酰胺酶相关基因。
【关键词】 鲍曼不动杆菌;耐药性;β-内酰胺酶;基因
Abstract: Objective: To understand the drug-resistance and the distribution of β-lactamases genes in Acinetobacter baumannii. Methods: Antimicrobial susceptibility was tested withVitek60-AMS. Genotypes of β-lactamase were analysed with polymerase chain reaction (PCR) andverified by DNA sequencing. Results: Of the 215 Acinetobacter baumannii strains，54.1% was susceptible to cefoperazone/sulbactam， 46.4% and 39.3% were susceptible to imipenem and meropenem， respectively. But these strains exihited lower susceptible to other antibiotics， especially to third generation cephalosporins (&<20%);of the 27 ESBLs positive strains， TEM-type was encoded in 16(7.4%)，SHV，CTX-M-1，OXAⅡtypes were encoded in 4(1.9%)，4(1.9%)and 3(1.4%)，respectively.The subtypes were TEM-1，SHV-1， CTX-M-15，CTX-M-22 and OXA-21. This studydid not dig out VEB，GES，CTX-M-2，CTX-M-8，CTX-M-9，TLA，IBC，OXA-10，OXAⅠ，OXAⅢ，OXAⅣ and OXAⅤgenes in all strains. AmpC was encoded in 129(60.0%)，including ADC 82(38.1%)，DHA 35(16.3%)，EBC 8(3.7%)，ACC 3 (1.4%) and CIT 1(0.5%)，respectively. No MOX，FOX and CARBgenes were detected. OXA-23 was encoded in 98(45.6%)in 215 strains. Conclutions: The multidrugresistance of Acinetobacter baumannii from clinical isolation is a serious issue. And theseisolations harbor all kinds of β-lactamase resistance genes，including TEM，ADC，DHA，OXA-23and so on.
Key words: Acinetobacter baumannii;resistance;β-lactamases;gene
近年来，鲍曼不动杆菌的耐药问题日益严重且受到广泛关注，多重耐药鲍曼不动杆菌已 成为医院感染的重要病原菌，其最重要耐药机制为细菌产β-内酰胺酶[1-2]。迄今为止，在该 菌中已发现包括SHV、TEM、CTX-M、PER、ADC、VEB、OXA-23等多种β-内酰胺酶基因[1-5]，但各国家和地区发现或流行的β-内酰胺酶型别不同，导致细菌的耐药特性也不尽相同，为了解温州地区鲍曼不动杆菌的耐药特点和基因分布特点，我们对温州医学院附属第一医院临床分离的215株鲍曼不动杆菌进行了β-内酰胺酶基因研究，报告如下。
1 材料和方法
1.1 菌株来源与鉴定
215株鲍曼不动杆菌为温州医学院附属第一医院2007年6月-2009年6月临床送检各类标本中连续分离的非重复菌株，所有菌株经过VITEK-60全自动细菌分析仪鉴定确认。标本来源包括痰液200株，引流液4株，血液3株，伤口3株，导管2株，敷料、腹水和眼分泌物各1株。质控菌株：铜绿假单胞菌ATCC27853购自卫生部临检中心。
1.2 抗菌药物敏感性试验
氨苄西林、哌拉西林/他唑巴坦、亚胺培南、美洛培南、环丙沙星、庆大霉素、氨曲南、头孢唑林、头孢他啶和头孢曲松采用VITEK-60细菌鉴定药敏系统检测;头孢哌酮/舒巴坦采用琼脂扩散法检测。药敏结果按美国临床实验室标准化研究所(CLSI)规则判定。
1.3 仪器设备
VITEK-60型全自动细菌分析仪，PCR扩增仪，低温冰箱，低温离心机，隔水式恒温培养箱，细菌比浊仪等。超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)阳性产物送北京六合华大基因股份有限公司测序。
1.4 DNA模板制备
采用煮沸法。将细菌在LB培养基中增菌培养12 h，离心后去上清，再用去离子水洗净细菌中残留的LB后煮沸15 min，冰敷5 min使DNA复性，12 000 r/min离心3 min，上清液即为所需的DNA模板。
1.5 PCR及测序引物
10种β-内酰胺酶基因检测均使用PCR法，靶基因引物序列和目的产物的长度见表1，各种靶基因PCR扩增体系均为：每反应体系引物P1、P2均为0.5μL(10 mmol/L)，dNTPs 2.5μL(1 mmol/L)，10倍缓冲液(KCl 10 mmol/L，(NH4)2SO4 8 mmol/L等不含Mg2+)2.5μL，Mgcl21.5μL，Taq DNA pol 0.1μL，超纯水15.4 μL，模板液2μL，总反应体积25μL。PCR反应参数如下：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共循环35次，最终72 ℃延伸10 min。扩增产物在1.0%琼脂糖凝胶中，电泳结束后在紫外凝胶成像仪下拍照。ESBLs阳性产物送北京六合华大基因股份有限公司测序。
1.6 核苷酸序列测定分析
选取部分ESBLs阳性产物送北京六合华大基因有限公司测序，方法按sanger双脱氧末端终止法进行正反向测序，结果在GenBank网上查对比较。
2 结果
2.1 抗菌药物敏感试验结果
215株鲍曼不动杆菌对11种临床常用抗菌药物的敏感试验结果见表2。
2.2 β-内酰胺酶编码基因PCR扩增结果
215株鲍曼不动杆菌中，27株(占12.6%)扩增到ESBLs基因;129株(占60.0%)扩增到AmpC基因。ESBLs和AmpC均阳性的菌株12株，其中1株菌同时携带CTX-M-1和OXA II基因。另外，98株(占45.6%)携带OXA-23基因。部分β-内酰胺酶基因PCR扩增产物电泳图见图1和图2。
2.3 PCR产物测序结果
TEM阳性产物与参考序列ACX83572 100%同源为TEM-1，SHV阳性产物与参考序列GU197545.1 100%同源为SHV-1，CTX-M-1阳性产物3个与GQ385309 100%同源为CTX-M-15，而另一株与GU125665 100%同源为CTX-M-22，OXA II阳性产物与CAA71699 100%同 源为OXA-21，本批菌株中未发现新的β-内酰胺酶基因型。
3 讨论
鲍曼不动杆菌是医院感染最重要的病原菌之一，可引起呼吸道、血液、伤口、尿道等多 部位和脏器的感染。本研究215株鲍曼不动杆菌中有200株自痰标本中分离，与菌株易在呼吸 道定植，且耐药严重，难以清除有关。本研究结果显示，鲍曼不动杆菌的耐药性相当严重。仅对酶抑制剂复合制剂头孢哌酮/舒巴坦的敏感性较高，超过50%，推测与舒巴坦对鲍曼不动杆菌的直接杀灭作用和其通过抑酶作用保护β-内酰胺酶类药物的功能有关[6];对三代头孢菌素的耐药性最严重，耐药率&>80%，与近些年来三代头孢菌素的广泛使用有关;值得关注的是，菌株对碳青霉烯类抗菌药物亚胺培南和美洛培南耐药率也很高，而且呈逐年上升趋势，与本地区分离鲍曼不动杆菌高产碳青霉烯酶OXA-23有关[3]。目前推荐临床上使用的抗菌药物仍然是含酶抑制剂类药物如头孢哌酮/舒巴坦和碳青酶烯类药物亚胺培南，因此，加强其耐药机制等研究，指导临床用药，控制耐药性的发展十分重要。产β-内酰胺酶是鲍曼不动杆菌耐药的主要机制[1-2，7]，并且在鲍曼不动杆菌中已发现多种β-内酰胺酶及相关基因，国内有TEM-1、SHV-18、PER-1、ADC、OXA-23[1，3，7]等发现。国外报道，有PER-1、TEM-1、VEB-1、OXA-23、CTX-M-2[4-5，8-9]等。ESBLs和AmpC酶是介导革兰阴性杆菌耐药的最主要的两种酶[10]。ESBLs与鲍曼不动杆菌对β-内酰胺类抗生素的耐药率显著相关，产ESBLs菌感染的患者通常大量使用过超广谱头孢菌素[2]，本次调查分离的鲍曼不动杆菌产ESBLs率为12.6%。因此，在临床用药时，必须控制超广谱头孢菌素使用的疗程和用量。
AmpC酶是由革兰阴性杆菌产生的能使包括第三代头孢菌素在内的许多β-内酰胺类抗生素失活的头孢菌素酶，即可由染色体介导也可以由质粒介导，由于其优先水解头孢菌素而被称为头孢菌素酶，本实验中高产ADC、DHA等AmpC酶成为鲍曼不动杆菌多重耐药的重要原因之一，ADC基因38.1%的高检出率值得重视，ADC型β-内酰胺酶为不动杆菌属特有的AmpC酶，距今发现的ADC亚型已超过30种，鲍曼不动杆菌所产的ADC型AmpC酶能水解青霉素类、第三、第四代头孢菌素类，克拉维酸和他唑巴坦对其抑制作用很弱，但可被舒巴坦所灭活，因此，在临床用药中，可以用含舒巴坦的复合药治疗[7]。本组实验中OXA-23基因的产率也很高，携带OXA-23型碳青霉烯酶基因的鲍曼不动杆菌对临床常用抗菌药的耐药率均较高，OXA-23酶是第一个从鲍曼不动杆菌中分离出来的D类碳青霉烯酶，其位于质粒或者染色体上，其多年来不断的进化突变作用，起到了重要的生物化学作用，可能是OXA酶对碳青霉烯类抗生素耐药进展的一个重要因素。
本研究中，临床分离的215株鲍曼不动杆菌携带至少10种β-内酰胺酶基因，是导致鲍曼 不动杆菌多重耐药的主要原因。但是，其中有24.7%的菌株超广谱β-内酰胺酶、AmpC酶和 OXA-23基因均阴性，三代头孢菌素仍然高水平耐药，推测与细菌对β-内酰胺类抗生素耐药 的其他机制，如膜孔蛋白缺失、青霉素结合蛋白(PBP)的改变、主动外排机制等[3]参与有 关。另外，不同β-内酰胺酶对抗菌药物的水解能力差异、基因定位和基因转移情况等还有 待于进一步研究，以从分子水平更好地了解细菌的耐药机制。
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