作者：童郁，邵展，许锴，张德亭
【摘要】 目的 ：了解女性下生殖道人乳头瘤病毒（HPV）感染的型别分布及特点。方法：采用核酸分子快速杂交分型技术对2008年1-12月间在温州医学院温州市第三临床学院妇产科就诊的2 735例女性进行生殖道21种HPV检测并分型。结果：HPV总感染率为38.7%（1 059/2 735），21种HPV亚型（除HPV43型外）均有检出，其中单一型感染率为22.8%(623/2735)，混合型感染率为15.9%(436/2 735)；HPV高危型感染率为31.3%(857/2 735)，HPV低危型感染率为8.9%(244/2 735)。在1 059例HPV DNA阳性感染者中检出率较高的HPV高危型有HPV16型（占17.7%），HPV52型（占12.2%），HPV58型（占13.5%）；低危型有HPV6型（占8.8%），HPV11型（占9.4%）。2 735例HPV感染高峰年龄在30～40岁（占11.7%），50～60岁年龄段下降至4%，各年龄段HPV感染检出率差异有显著性（P &<0.01）。结论：在温州地区，30～40岁为HPV感染的高峰年龄，高危人群HPV感染率达38.7%，HPV感染的常见型别为HPV16，HPV52，HPV58，HPV6和HPV11。
【关键词】 人乳头瘤病毒 基因分型 DNA杂交
人乳头瘤病毒(HPV)是一种小的DNA双链病毒，可以特异性地感染人皮肤和黏膜的鳞状上皮细胞，引起多种良、恶性病变。在HPV感染导致的疾病中，最常见的就是尖锐湿疣和宫颈癌。根据感染的致癌性与否又可分为高危亚型和低危亚型。HPV的致病性与其亚型有关，如低危亚型感染仅诱发生殖器疣样病变，高危亚型感染是导致宫颈癌发生最主要的原因。为了解本地区女性HPV的感染情况和型别分布，我们对2008年1-12月来我院就诊的2 735例的女性下生殖道标本进行了HPV基因分型检测，报告如下。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 一般资料：病例来源于本院妇产科门诊就诊、自愿接受生殖道HPV感染筛查的有性生活妇女，选取2 735例有宫颈炎症或宫颈糜烂等临床指征的病例做HPV检测。年龄16～70岁，平均年龄(35.6±10.6)岁。从年龄≤20岁开始，以10岁为一年龄段，到≥60岁，分为6个年龄组。
1.1.2 标本采集及保存方法：用窥阴器暴露宫颈，拭去宫颈口黏液，将宫颈刷置于宫颈口，轻轻搓动宫颈刷使其顺时针方向旋转5周。慢慢取出宫颈刷。将其放入标有患者编号的取样管内，取样管中已加有专用细胞保存液，拧紧瓶盖。标本在室温保存放置不超过2 h，4 ℃保存不超过24 h， -20 ℃保存不超过3个月。样本应避免反复冻融。
1.1.3 试剂及仪器：HPV分型基因芯片检测系统；HbriMax医用核酸分子快速杂交仪和HPV扩增分型检测试剂盒(凯普生物化学有限公司，上海)；PE5700基因扩增仪(PE公司，美国)；DNA提取试剂盒(达安公司)。
1.2 方法
1.2.1 样本处理：将装有样本的微量离心管，以14 000 r/min速度离心5 min，弃上清，保留管底沉淀物，加入50μL裂解液悬浮沉淀，100 ℃加热10 min，以14 000 r/min速度离心10 min，取上清液按DNA提取试剂盒步骤操作。
1.2.2 PCR扩增：取PCR反应管1支，在管壁上做好标记，分别加入已提取的待测样品DNA 1μL，反应总体系25μL，每次实验必须设置一个阴性对照及阳性对照，处理方法同标本。PCR反应条件为20℃ 10 min，95 ℃ 9 min，尔后循环40次(95 ℃，20 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s)；72 ℃延伸5 min。
1.2.3 杂交及显色：将PCR产物20μL在95 ℃加热5 min，然后冰水浴至少2 min；让杂交仪预热45 ℃，在杂交孔内放好膜芯片，用1 mL杂交液预处理分子膜；将产物20μL加入杂交液(45 ℃)混匀。加在分子膜上温育10 min，排泵，杂交液冲洗膜3次，设定温度25 ℃，用0.5 mL的封阻液封闭5 min，排泵，加入0.5 mL酶标液，温育4 min；设置温度36 ℃，用溶液a洗膜4次，加入0.5 mL NBT/BCIP显色液3 min，用溶液b洗膜4次，观察结果。当对照膜条PC点出现BIOTIN点和IC 点蓝色斑点时提示PCR、杂交、显色等各个环节操作正常，此时结果真实有效。
2 结果
2.1 HPV感染的型别分布
在2 735例样本中检出HPV DNA阳性病例1 059例，阳性检出率为38.7%，检出高危基因型(HPV16/18/31/33/35/39/45/51/52/56/58/68型)857例，阳性率为31.3%；检出低危型(HPV6/11/42/43/44型)244例，阳性率为8.9%；检出常见亚性（HPV53/66/cp804）177例，阳性率为6.5%。HPV各亚型检出情况见表1。在1 059例HPVDNA阳性感染者中检出率较高的HPV高危型有HPV16型，HPV52型，HPV58型，低危型HPV6型，HPV11型。其中检测过程中发现有多重型感染患者，在检出类型中单一型感染率为22.8%（623/2 735），混合型感染率为15.9%（436/2 735），最多出现达6种型别混合感染，见表2。
2.2 HPV感染的年龄分布
各年龄段HPV感染检出率见表3。HPV感染率在30～40岁年龄段达高峰，50岁后就明显下降，感染人群高峰年龄出现晚，但下降比较快。用SPPS10.0软件列联表资料分析，x2=18.23，P &<0.01，各年龄段HPV感染检出率差异有显著性。
3 讨论
世界范围内1/5的肿瘤与感染因子有关，其中子宫颈癌与人乳头状瘤病毒(HPV)的关联最为密切。大量流行病学研究已证实，发生子宫颈癌的必要条件是高危型HPV持续感染。目前，子宫颈癌的一级和二级预防正逐步向预防、检测和控制HPV感染的方向发展。通过大规模人群中HPV感染情况的调查，可以了解以HPV检查为基础的筛查方法在中国女性子宫颈癌预防中的作用，并为HPV疫苗的研制开发提供依据。
性生活是HPV感染的常见传播途径，感染者通常无明显的临床症状，易被人们忽视。据调查，宫颈癌是目前妇女致死的第二大病因，而HPV高危亚型持续感染又是导致宫颈癌变的一个必不可少的因素。年龄是宫颈癌和HPV感染的相关因素。本研究显示：HPV感染率在30～40岁年龄段达高峰，50岁后就明显下降，感染人群高峰年龄出现晚，但下降比较快。30岁后5%～10%的人为高危HPV感染持续状态，有更高的风险患上宫颈癌，从HPV感染到子宫颈癌前病变再到宫颈癌需要一段较长的时间，而子宫颈癌是感染性疾病，可以预防且治愈率高。筛查是现阶段控制和预防子宫颈癌的主要手段，在此时间内，只要定期进行高危型HPV的检查，就可以有效地减少妇女死于宫颈癌的几率。
我们利用杂交技术[1-2]检测2 735例样本中HPV DNA，检出阳性病例1 059例，阳性率接近40%。但比绍兴地区（51.54%）、宁波地区（49.4%）、武汉（64.5%）、粤东地区（48.3%）感染率都低[3-6]，但高于北京地区[7]（17.0%）。HPV DNA高危亚型检出857例，低危亚型检出244例；单一型感染623例，复合型感染436例。对于从表1中观察到，HPV16，HPV52，HPV58，HPV6，HPV11共占了HPV亚型的60%以上，为高发的亚型，而且HPV52和HPV58型与HPV16型多重合感染病例。其感染亚型分布与绍兴地区[6]相同，而与广州东部地区[8]、北京地区[7]不同，说明HPV各亚型感染存在地区差异。本研究HPV16型感染率最高，与文献[3-7]报道一致，但与广州东部地区[8]以HPV52为主不同。下生殖道HPV感染易复发，高危HPV感染持续存在可能发展为宫颈癌，随诊十分重要。虽然HPV感染是子宫颈癌及其癌前病变最主要的因素，然而，只有部分人感染了HPV后才能发生不同程度的子宫颈病变，最终发展为子宫颈癌。其中HPV感染型别是决定不同进展方向的主要因素之一。对于子宫颈高度病变者，本研究中HPVl6是最主要的感染型别。由于HPVl6更具有逃避免疫监测的能力，因此HPVl6被认为是引起高度病变走向恶性病变的最主要型。虽然HPV52和HPV58型的清除率被认为介于HPVl6与低危型之间[9]，值得注意的是，本次研究证明，除HPVl6型之外，HPV感染的其他主导型别为HPV52和HPV58型，合计占人群高危型感染的25%以上。在CINII以上病变中，HPV52和HPV58也是除了HPVl6型之外的主导型别，其感染优势明显高于HPVl8型。目前，最为理想，且能从根本上预防宫颈癌的方法就是采用疫苗进行人群一级预防。现有的疫苗都仅仅针对HPVl6和HPV18型，这对现有疫苗在亚洲人群中的保护效果提出了挑战。八价疫苗(包括HPVl6，HPV18，HPV58，HPV33，HPV52，HPV31，HPV35和HPV45型)概念的提出，从理论上可以预防亚洲地区86.4%的潜在感染[9]。鉴于预防型疫苗使用时必须面临的经济可承受性的问题，尤其是在经济处于发展中的中国地区而言，八价疫苗的可行性尚有待研究。然而，HPV52和HPV58型在亚洲，包括中国地区的特殊性不可忽视，将其引入新一代疫苗在HPV感染与子宫颈癌的防治工作中具有重要意义。
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