作者：余雪姣，郑晓群，郑昭，金晶，彭颖
【摘要】 目的 ：探讨两步法从人白血病细胞株(KG-1)体外诱导分化成树突状细胞(DC)的技术。方法：利用两步诱导法，先在培养体系中加入FLT3配体(Flt3-ligand)、血小板生成素(TPO)及干细胞因子(SCF) 三种细胞因子，对KG-1细胞进行扩增培养5 d ;扩增后的细胞在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素4(IL-4)和肿瘤坏死因子(TNF-α)的作用下诱导7 d，镜下进行形态学观察并用流式细胞仪分析树突状细胞特征性表面标记CD40、CD80、CD86、HLA-DR的表达情况。结果：诱导7 d细胞胞体较大，表面出现许多树突状突起;树突状细胞特征性表面标记CD40、CD80、CD86、HLA-DR表达阳性率显著升高。结论：两步法能促使KG-1细胞分化成具有典型形态和表型特征的DC细胞。
【关键词】 KG-1细胞;树突状细胞;细胞因子;诱导
Abstract: Objective: To explore the technigue ofgeneration of dendritic cells from human leukemia cell line KG-1 after induction in vitro. Methods: Two-step inductions were carried out: At first，KG-1 cells were treated with Flt3-ligand， TPO and SCF for 5 days. Then the cells were exposed to factors including GM-CSF，IL-4 and TNF-αfor 7 days to acquire the properties of mature DC. In day 7，the cells morphology were observed under invert microscopy and the phenotype markets (CD40， CD80， CD86， HLA-DR)were detected with FACS. Results: After induction with cytokines，KG-1 exhibited morphologic and phenotypic properties of typical dendritic cells. Conclusion: It is possible to generate typical morphological and phenotypic DCs from KG-1 cells by two step process differentiation.
Key words: leukemia cell line;dendritic cells;cytokines;differentiation
树突状细胞(dendritic cell，DC)是体内强有力的抗原提呈细胞(antigen-presenting cell，APC)，在免疫反应中起了举足轻重的作用，能诱导静息T细胞，激发初级免疫反应，在炎症、自身免疫、移植免疫及肿瘤免疫诸多过程中起非常重要的作用[1]。目前，DC在人体内虽分布广泛但数量极少，呈高度分化状态，体外不易长期培养，更难建系，这限制了人们对其生物学特性等方面的进一步研究，因此如何获得大量高纯度DC是目前DC研究的热点之一。Berges等[2]报道，人白血病细胞株(KG-1)体外经GM-CSF、TNF-α等细胞因子作用可直接诱导生成形态、表型和功能性DC。我们在国外研究的基础上做了改进，采用两步法诱导，先对KG-1细胞进行扩增，再对扩增后的细胞进行诱导，诱导后的细胞从树突状细胞形态学、特征性表面标记两方面证实为DC细胞。现报告如下。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 试剂：RPMI IMDM培养液为GIBCO公司产品，购于上海吉诺生物医药技术有限公司;胎牛血清(FBS)和2-巯基乙醇为GIBCO公司产品，购于上海普飞生物技术有限公司。细胞因子均为人重组蛋白，干细胞因子(stem cell factor，SCF)、FLT3 配体(flt3-ligand，FL)、血小板生成素(thrombopoietin，TPO)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colonystimulating factor，GM-CSF)、白细胞介素4 (interleukin 4，IL-4)、肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF-α)为Peprotech产品，购于杭州联科生物技术有限公司。CD80、CD86、CD40、HLA-DR单抗为ABR产品，购于杭州联科生物技术有限公司。
1.1.2 细胞：KG-1细胞，为人白血病细胞，购于上海中科院细胞库。
1.2 方法
1.2.1 KG-1细胞的培养：KG-1细胞以1×106 cells/mL的密度接种于6孔板中，基础培养基为IMDM，添加10% FBS、4 mmol/L谷氨酰氨、100 U/ mL青霉素、100μg/mL链霉素和30μmol/L二巯基乙醇，于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养，隔天换液，细胞每48小时可扩增一倍。
1.2.2 KG-1细胞的诱导扩增：KG-1细胞以1×106 cells/mL的密度接种于6孔板中，基础培养基为IMDM，添加10% FBS、10 ng/mL TPO+20 ng/mL SCF+25 ng/mL Flt3-ligand三种细胞因子、4 mmol/L谷氨酰氨、100 U/mL:青霉素、100μg/mL链霉素和30μmol/L二巯基乙醇，于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中诱导扩增培养5 d。
1.2.3 树突状细胞的诱导：将细胞分成2份，一份作为实验组，经前三种细胞因子诱导扩增5 d的细胞以1×106 cells/mL的起始密度接种于6孔板中，细胞由基础培养基IMDM中添加5% FBS、4 mmol/L谷氨酰氨、100 U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、30μmol/L二巯基乙醇、10 ng/mL GM CSF+10 ng/mL IL-4+40 ng/mL TNF-α构成的细胞因子组合诱导，隔天换液，培养时间共计7 d。另一份作为对照组，以相同起始密度的细胞接种于6孔板中，培养液不添加细胞因子，对照组同样隔天换液，置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养7 d。
1.2.4 流式细胞仪(FCM)分析免疫标记：培养结束后取实验组和对照组的细胞，经离心(1 000次/min，5 min)后取沉淀细胞用PBS洗涤2次，调整细胞浓度为1×106/mL，加入FCM专用分析试管，分别加FITC标记的小鼠抗人单抗CD80/FITC、CD86/PE、CD40/FITC、HLA-DR/PE各10μL，4 ℃孵育30 min，同时设阴性对照，PBS洗涤后标记的细胞通过流式细胞仪检测细胞免疫标记。
2 结果
2.1 形态学鉴定 倒置显微镜下，与正常KG-1细胞相比，经GM-CSF、IL-4、TNF-α三种细胞因子诱导7 d的，细胞体积增大，可见明显的树突状突起，具有典型的树枝状或裙褶状突起。
2.2 流式细胞仪检测DC特征性表面标记CD40、CD80、CD86、HLA-DR，与对照组相比，实验组能诱导表达DC细胞特征性细胞表面标记。
3 讨论
DC是功能最强的专职抗原提呈细胞，在肿瘤免疫中起着关键的作用，是新兴的细胞免疫治疗中的重要组成部分，因而诱导扩增DC在研究其生物学特性及临床应用方面都具有十分重要的意义。目前，人们已能从人外周血、脐血、骨髓等扩增出一定数量的DC，但其不足之处是从外周血分离DC的方法比较繁琐且产量低[3];一份脐血CD34+造血干细胞诱导的DC数量不能满足临床应用的需要;人体的骨髓来源又较为困难，诱导DC所需细胞因子量较大等;总之，以上三种方法具有繁琐、产量低、成本高、纯度低等缺点[5]。国外一些研究报道显示，人KG-1细胞株经细胞因子可直接诱导成DC细胞，并且被用作是DC分化的模式细胞[4-5]。在本实验中，我们探索两步法将KG-1细胞诱导成树突状细胞，取得了令人鼓舞的结果。我们先用Flt3-ligand、TPO、SCF三种细胞因子扩增KG-1细胞，然后在第二步中用GM-CSF、IL-4、TNF-α三种细胞因子将扩增后的细胞诱导成为DC。
细胞因子对DC的分化、成熟起到关键作用，无论用哪种方法，若想获得大量较纯的DC，就需要在不同时期加入适当的CK来维持其扩增和诱导。目前成熟使用的细胞因子主要有：GM-CSF、IL-4、TNF-α、SCF、TPO、CD40L、PGE2等[6]。
在本实验中，第一步诱导中我们用TPO、SCF、Flt3-ligand三种细胞因子组合扩增KG-1细胞。TPO可明显促进集落生长，使集落增大，具有促原始祖细胞分化作用。此外，TPO也具有刺激早期造血祖细胞增殖的作用，与其他细胞因子协同可明显扩增早期造血祖细胞。SCF是扩增中最重要的生长因子，SCF与其他造血调节因子一起，有很强的刺激作用。所以，SCF是重要的协同因子用于体外扩增的细胞因子通常包括作用于早期[7]。Flt3-ligand能够刺激早期造血的细胞因子，调节造血干/祖细胞的增殖和分化[8]。第二步诱导中用GM-CSF、IL-4、TNF-α将扩增后的细胞诱导成为DC[9]。GM-CSF的作用主要是使KG-1细胞向DC及巨噬细胞分化，在前期加入GM可能会促使干细胞向巨噬细胞方向分化以致总细胞中DC前体下降，在后期无法诱导出DC。IL-4和TNF-α的作用是抑制巨噬细胞的生成，使更多的细胞分化成为DC并促进DC的成熟。GM-CSF联合IL-4和TNF-α时，则产生大量表型及形态均典型的DC[10]。
本实验结果显示，光镜下，与正常KG-1细胞相比，经三种细胞因子诱导7 d后的DC和外周血、脐血、骨髓来源的DC相似，细胞体积增大，表面伸出毛刺状突起。细胞表型检测显示树突状细胞特征性表面标记CD40、CD80、CD86、HLA-DR表达增多。本实验表明，我们可通过两步法将KG-1细胞大量诱导成DC细胞。另外，KG-1细胞株来源方便，可冻存，解决了以往DC前体来源困难的缺点，这对今后开展大量DC相关性研究及临床实验都具有十分重要的意义。
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