外周血MUC1基因表达与食管癌微转移的关系

　　　　　　 作者：施舜缤，俞力超，胡嘉波，朱孝中，许文荣

【关键词】 食管癌; 黏蛋白; 微转移; 逆转录聚合酶链反应

　　1 资料与方法

　　1.1 病 例

　　无转移组:选择2006年1月至2006年5月我院病理确诊为食管鳞癌而经B超、CT或术中探查未发现有远处转移的患者53例。转移组:同一时期病理确诊为食管鳞癌，又经B超、CT或术中探查明确发现有远处转移的患者10例。良性对照组:同一时期的食管炎7 例，贲门失弛症2例，食管烧伤1例。

　　1.2 标本采集和处理　

　　无转移组、对照组所有患者于采集标本前均未行任何针对肿瘤的治疗，采外周血(采集标本均需肝素抗凝)，先抽出1 ml弃去，再留取5 ml。红细胞裂解液裂解红细胞， 分离有核细胞，液氮速冻后，-80℃保存备用。

　　1.3 方 法　

　　采用Trizol试剂提取细胞总RNA， 所提RNA经1％琼脂糖电泳鉴定。以1 μg为模板，以OligodT作引物，置于70℃温浴5 min后，冰浴2 min，再加入逆转录酶、dNTP等，在42℃温浴1.5 h合成cDNA， 94℃灭活逆转录酶及预变性5 min，以cDNA为模板进行PCR 扩增。MUC1基因引物设计序列如下［2，3］(外引物A和B，内引物C和D，产物分别为510 bp，287 bp) A:5′ATGCCAGTAGCACTCACCATAG3′；B:5′CAGCCAAGGCAATGAGATAGAC3′;C:5′CGTCGTGGACATTGATGGTACC3′；D: 5′GGTACCTCCTCTCACCTCCTCCAA3′。β肌动蛋白作为内对照标准，引物序列E:5′TCATCACCATTGGCAATGAG3′；F:5′CACTGTGTTGGCGTACAGGT3′，产物为154 bp。引物均由上海生工生物工程技术服务公司合成。巢式RTPCR扩增条件：第1次，94℃ 90 s后，94℃ 15 s，55℃ 30 s，68℃ 45 s 循环35次；68℃终延伸5 min，扩增产物510 bp。第2次，94℃预变性90 s，94℃ 15 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，循环30次；72℃终延伸2 min。配制1.8%琼脂糖凝胶，产物电泳，经溴化乙啶(EB) 显色得到特异性条带者为阳性检出。

　　1.4 统计学分析　

　　应用SPSS11.0软件进行统计分析，采用χ2检验， P&<0.05为有差异有统计学意义。

2 结 果

　　2.1 总RNA鉴定

　　经过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，18 S和28 S条带清晰可见，见图1。

　　2.2 各组之间阳性率比较　

　　以β肌动蛋白的RTPCR扩增产物量为依据，调整巢式RTPCR 模板量，标本MUC1表达结果见图2。良性对照组10例外周血中无MUC1 mRNA阳性表达。无转移组MUC1 mRNA 阳性检出率为39.6%(21/53)，转移组MUC1 mRNA阳性检出率90.0%(9/10)，结果见表1，各组间差异有统计学意义(χ2=6.66， P&<0.01)。表1 患者术前外周血MUC1 mRNA的检测结果（略）

　　2.3 无转移组阳性分布与病理分化程度的关系

　　不同病理分化程度之间的MUC1 mRNA阳性检出率差异无统计学意义(P&>0.05)。结果见表2。表2 无转移组术前外周血中MUC1 mRNA检测
阳性分布与病理分化程度的关系（略）

　　2.4 食管癌患者阳性表达与国际TNM分期的关系

　　MUC1 mRNA阳性率随TNM分期升高而升高。但Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ期之间相比检出率差异无统计学意义(P&>0.05)；而Ⅳ期与Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ期相比阳性检出率差异有统计学意义(P&<0.05)。见表3。

　　3 讨 论

　　肿瘤微转移一般指恶性肿瘤细胞播散于淋巴结、骨髓、外周血及其他组织器官中，尚未形成转移性结节，无任何临床表现，常规方法难以发现和检测到的转移［4，5］ 。肿瘤临床转移一般都由微转移发展而来，对肿瘤微转移的检测是临床判断治疗效果、预示肿瘤复发的有效手段。有关食管癌的微转移研究起步较晚，一般局限于食管癌淋巴结的微转移方面［6，7］。外周血液的微转移研究较少，有证据表明食管癌患者外周血循环中也存在肿瘤细胞，提示食管癌患者并非中晚期才发生血性转移［8，9］。早期发现肿瘤微转移对肿瘤的分期、复发、预后有重要的意义。表3 食管癌患者术前外周血中MUC1 mRNA检测阳性分布与国际TNM分期的关系（略）

　　常规RTPCR技术一般1 ml全血中含有100个肿瘤细胞以上时才可能被检测出。采用巢式RTPCR 技术，即用两对引物进行两轮RTPCR扩增，第2对引物序列在第1对引物扩增的RTPCR 产物片段内，那么灵敏度可提高到1 ml全血中含有1个肿瘤细胞就能被检测出［10］。我们应用巢式RTPCR技术检测了53例食管癌患者术前外周血标本，发现MUC1 mRNA阳性率为39.6%(21/53)，已经发生临床转移的食管癌患者阳性率为90.0%(9/10)；不同病理分化程度之间阳性检出率无统计学意义，可能与病例数较少有关；MUC1 mRNA阳性率随TNM分期升高而升高，Ⅳ期与Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ期相比阳性检出率有差异有统计学意义(P&<0.05)。阳性率与生存率之间的关系正在随访之中。而良性对照组无一例MUC1 mRNA阳性，提示该方法具有较高的特异性。Kimura等［11］的研究表明，血液中微转移食管癌肿瘤细胞的出现是一个独立预后因素，检测微转移肿瘤细胞具有重要意义。外周血液标本较易获得，可反复取样，动态观察。但应该考虑到外周血采血时间、部位、血量、时间间隔等对检测结果有一定影响。微转移肿瘤细胞进入血液的释放规律、阳性检出率与肿瘤转移及复发的相关性还有待于进一步研究和探讨。

参考文献

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　　［6］何金涛，朱江，李强.食管癌淋巴结微转移检查［J］.现代预防医学，2008，35(11):2176-2177.

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　　［9］Liu Z， Jiang M， Zhao J， et al.Circulating tumor cells in perioperative esophageal cancer patients: quantitative assay system and potential clinical utility［J］.Clin Cancer Res，2007，13(10):2992-2997.

　　［10］Reiter W， Stieber P， Reuter C， et al.Multivariate analysis of the prognostic value of CEA and CA199 serum levels in colorectal cancer［J］.Anticancer Res，2000，20(6D):5195-5198.

　　［11］Kimura H，Kato H，Faried A，et al.Prognostic significance of EpCAM expression in human esophageal cancer［J］.Int J Oncol，2007，30(1):171-179.