MCP1基因A2518G多态性与不稳定性心绞痛关系的初步分析

　　 作者：师干伟，何国平，戚传平，高磊，戚猛，沈丹丹，钱志宏，许联红

【摘要】 目的： 探讨中国苏南地区汉族人群单核细胞趋化蛋白1（MCP1）基因启动子A2518G单核苷酸多态性与不稳定性心绞痛（UAP）的相关性。方法： 采用病例对照研究方法，选择临床确诊的UAP患者172例为病例组和经冠脉造影检查证实无冠脉病变者156例为对照组。利用聚合酶链式反应限制性酶切片段长度多态性技术（PCRRFLP）对MCP1基因 A2518G行多态性检测，并统计各基因型及等位基因的频率分布。结果： 与对照组相比，UAP组的AA，AG和GG基因型频率差异均无统计学意义（P值分别为0.067，0.825和0.281）。G等位基因频率在UAP组和对照组分别为54.36%和61.22%，两组间差异无统计学意义（P=0.069）。对多个相关因素行多元Logistic回归分析显示，MCP1基因A2518G单核苷酸多态性与UAP的发病无相关性（P&>0.05）。结论： 在中国苏南地区汉族人群中，MCP1基因A2518G 单核苷酸多态性与UAP无显著相关性。

【关键词】 不稳定性心绞痛； 单核细胞趋化蛋白1； 单核苷酸多态性

　　［Abstract］Objective: To investigate the possible association between the monocyte chemoattractant protein1(MCP1) gene A2518G single nucleotide polymorphism(SNPs) in the promoter region with unstable angina pectoris(UAP) in Chinese Han population of Sunan region. Methods： This study was conducted with a casecontrol design including 172 patients with UAP(UAP group) and 156 control subjects who were free from coronary artery disease by Coronary Angiography checks(control group). Polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism(PCRRFLP) was used for the detection of the A2518G polymorphism in MCP1 gene，and then the frequency of genetype was statistically analyzed. Results： Compared with the control group， the frequencies of AA，AG and GG genotype were not significantly different in UAP group(P was 0.067，0.825 and 0.281， respectively). The prevalence of G allele was 54.36% and 61.22% respectively in the UAP group and control group; there was no difference between them in statistics(P=0.069). Multivariate logistic regression analysis indicated that there was no significant correlation between MCP1 gene A2518G polymorphism with UAP(P&>0.05). Conclusion： Our data shows that MCP1 gene A2518G polymorphism is not associated with the risk of UAP in the Chinese Han population of Suwan region.

　　［Key words］unstable angina pectoris; monocyte chemoattractant protein1; single nucleotide polymorphism

　　不稳定性心绞痛( unstable angina pectoris， UAP)主要是冠状动脉内粥样斑块不稳定而引起血栓形成、管腔闭塞所导致急性心肌缺血的一组临床症状。病理学研究显示，在易损斑块内可见炎性细胞（主要是巨噬细胞）浸润。已有研究表明，单核细胞趋化蛋白1(MCP1)基因启动子区A2518G单核苷酸多态性与血清MCP1浓度［1，2］和冠心病均存在相关性［1，3］，但其他关于该位点单核苷酸多态性与心血管疾病易感性的研究结果并不完全一致［4，5］。基于上述研究背景，本研究以苏南地区汉族人群为研究对象，对UAP 患者的MCP1基因A2518G单核苷酸多态性进行分析。

1 资料与方法

　　1.1 研究对象

　　所有入选者均为2005年6月至2009年6月期间在江苏大学附属武进医院心内科的住院患者。其中确诊为UAP者（UAP组）172例，男119例，女53例，年龄 30～85（65.57 ±10.55）岁，均符合2002年AHA/ACC关于UAP的诊断标准，并有2名或2名以上医师共同诊断，其中1名为主治或主治以上医师。选择同期住院并行冠状动脉造影排除冠状动脉病变者（对照组）156例，男73例，女83例，年龄30～76（55.80±11.70）岁。所有研究对象排除严重肝肾功能不全、肿瘤、风湿类疾病和急性或严重慢性感染者。该研究经本院医学伦理委员会批准，并征得所有入选对象知情同意。
　　
　　1.2 研究方法

　　1.2.1 一般资料采集

　　使用统一表格记录所有入选对象的基本资料，包括年龄、性别、吸烟史、高血压史、糖尿病史、家族史、血脂、血糖和冠状动脉造影等结果。

　　1.2.2 基因多态性检测

　　1.2.2.1 DNA提取

　　入选对象禁食12～14 h后抽取外周静脉血5 ml置入EDTA抗凝管，按照下列步骤提取DNA：（1）在离心机中离心后采用低渗液裂解红细胞；（2）离心机离心后分离出白细胞，加入蛋白酶K后37℃水浴过夜消化；（3）采用经典的酚氯仿法提取白细胞基因组DNA，置于70℃冰箱保存备用。

　　1.2.2.2 引物设计和合成

　　根文献［3］和MCP1基因GenBank注册号设计引物。上游引物：5′TCTCTCACGCCAGCACTGACC3′，下游引物：5′GAGTGTTCACATAGGCTTCTG3′（引物由大连宝生物公司合成）。扩增目的片段大小为234 bp。

　　1.2.2.3 PCR扩增与基因分型

　　采用聚合酶链式反应限制性片段长度多态性方法（PCRRFLP）进行基因型分型。第一步行PCR扩增：（1）扩增体系：反应总体积为25 μl，其中包括热启动混合Taq酶12.5 μl（由大连宝生物公司提供）、DNA模板1 μl、引物(浓度10 μmol/L)各0.5 μl和去离子水10.5 μl。（2）扩增条件：95℃预变性5 min；然后以95℃ 40 s，60℃ 30 s和72℃ 40 s共行35个循环，最后72℃延伸10 min。（3）检测目的片段：扩增结束后，取4 μl PCR扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳10 min，确定PCR产物为所需要的目的片段（234 bp）。第二步对目的片段行限制性酶切：（1）酶切反应体系：反应总体积为20 μl，其中包括PCR产物10 μl，PvuⅡ内切酶1 μl（由大连宝生物公司提供）、缓冲液2 μl和去离子水7 μl。（2）酶切反应条件：37℃水浴酶切过夜。第三步基因分型：取酶切产物10 μl加6×DNA上样缓冲液1.5 μl，在含胶红染料的2%琼脂糖凝胶中电泳30 min，然后在紫外线凝胶成像仪中观察、记录并保存电泳结果。（3）抽样检测目的片段：抽样回收目的DNA片段送大连宝生物公司行基因测序，进一步验证目的片段。

　　1.2.3 血脂检测

　　包括血总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇（HDL）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL）等，以上生化指标均由江苏大学附属武进医院检验中心在自动生化分析仪上统一测定。

　　1.2.4 统计分析

　　采用SPSS 10.0软件进行统计分析。计量资料以±s表示，组间比较采用t检验；基因型和等位基因频率分布采用直接计数法统计；计数资料比较采用χ2检验，关联程度用优势比（odds ratio， OR）和95%可信区间（confidence interval， CI）表示；多种相关因素分析采用Logistic回归分析；以P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 UAP组与对照组的临床资料比较

　　与对照组相比，UAP组年龄较大，男性、吸烟者和合并糖尿病者较多，血清TC，TG和LDL水平明显增高（表1）。表1 UAP组和对照组一般临床资料比较（略）

　　2.2 基因分型
　　
　　MCP1基因A2518G多态位点经PCR扩增后获得大小为234 bp目的片段，如有A→G替换，则产生PvuⅡ内切酶酶切位点，因此，PCR产物经PvuⅡ内切酶消化，可在琼脂糖凝胶电泳中观察到3种基因型，即AA纯合型（234 bp），AG杂合型（234 bp，159 bp和75 bp）和GG纯合型（159 bp和75 bp）（图1）。PCR产物经测序进一步验证（图2）。

　　2.3 基因多态性分析

　　MCP1基因A2518G单核苷酸多态性在UAP组和对照组中均存在AA，AG和GG基因型；两组间的3种基因型频率分布和G等位基因频率比较均无统计学意义（表2）；经多因素Logistic分析，未发现这3种基因型与UAP的发病存在相关性（表3）。表2 UAP组与对照组MCP1基因A2518G多态性基因型及等位基因频率的比较（略）表3 MCP1基因A2518G多态性基因型与UAP的关系（略）

3 讨 论

　　冠状动脉内粥样斑块的不稳定是UAP的主要发病机制，其中炎症反应可能是导致斑块破裂的一个重要因素［6］。MCP1作为一种重要的炎症趋化蛋白，主要趋化血液中的单核细胞进入血管内皮下，从而参与了动脉粥样硬化形成；同时单核/巨噬细胞在动脉粥样斑块进展过程中分泌基质蛋白酶，破坏纤维帽结构，最终导致粥样斑块的破裂［7］。已有研究报道，血清MCP1浓度升高与急性冠脉综合征（ACS）发病密切相关［8］。近年来，随着分子遗传学的发展，从基因水平研究MCP1与冠心病的关系已成为热点。有文献显示，MCP1基因启动子区 A2518G单核苷酸多态性GG基因型与血清MCP1水平成正相关［1，2］。然而，在不同的研究中，该基因单核苷酸多态性与心血管疾病的发病关系尚存在争议［1，3-5］。

　　本研究对328例中国苏南地区汉族人采用PCRRFLP检测了MCP1基因A2518G单核苷酸多态性，发现其表现为AA，AG和GG 3种基因型。其中，经冠状动脉造影证实的健康对照组人群AA，AG和GG基因型频率分别为11.54%，54.49%和33.97%，而已有研究显示，在高加索［2］和土耳其［4］健康人群中分别为49%，43%，7%和53.7%，34.4%，11.9%。由此可见，MCP1基因A2518G单核苷酸多态性存在种族差异。
　　
　　与对照组比较，UAP组MCP1基因A2518G多态性3种基因型的频率分布均无统计学差异（P&>0.05），在经Logistic回归分析调整了性别、年龄、吸烟、高血压、糖尿病、TC，TG，LDL和HDL等多个因素后亦未能得到有意义的阳性结果，这与前人研究结果并不相符［1，3］。在美国人群中，McDermott等［1］研究认为该基因位点GG基因型与心肌梗死显著相关；Szalai等［3］对318例患冠心病的匈牙利人群进行研究，发现GG基因型可能是冠心病发病的遗传危险因素。这种差异可能与下列因素有关：①该基因单核苷酸多态性存在显著的种族差异性；②心血管疾病是一种复杂的多基因遗传性疾病，而且外部环境因素也参与该疾病的发生和发展过程；③试验设计方法和入选样本存在不均一性，如研究对象不尽相同等。
　　
　　综上所述，本课题首次研究MCP1基因A2518G单核苷酸多态性与UAP发病的关系，结果表明，中国苏南地区汉族人群中存在MCP1基因A2518G单核苷酸多态性，但与UAP发病并不相关。结合国外研究结果分析提示，该基因单核苷酸多态性存在种族差异性。本研究结果补充了MCP1基因多态性对UAP易感性影响的数据库信息，为冠心病的一级康复干预提供了一些实验数据。关于MCP1基因启动子A2518G单核苷酸多态性与冠心病的确切关系尚需多中心、大样本、前瞻性研究。

参考文献

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　　［2］Rovin BH，Lu L，Saxena R. A novel polymorphism in the MCP1 gene regulatory region that influences MCP1 expression ［J］. Biochem Biophys Res Commun，1999， 259(2):344-348.

　　［3］Szalai C，Duba J，Prohaszka Z， et al. Involvement of polymorphisms in the chemokine system in the susceptibility for coronary artery disease(CAD).Coincidence of elevated Lp(a) and MCP12518G/G genotype in CAD patients ［J］. Atherosclerosis， 2001， 158(1):233-239.

　　［4］Cam SF， Sekuri C， Sagcan A， et al. Effect of monocyte chemoattractant protein1(MCP1) gene polymorphism in Turkish patients with premature coronary artery disease ［J］. Scand J Clin Lab Invest， 2008， 68(8):801-805.

　　［5］Cermakova Z， Petrkova J， Arakelyan A，et al. The MCP12518(A to G) single nucleotide polymorphism is not associated with myocardial infarction in the Czech population ［J］. Int J Immunogenet， 2005， 32(5):315-318.

　　［6］Boyle JJ. Macrophage activation in atherosclerosis: Pathogenesis and pharmacology of plaque rupture ［J］. Curr Vasc Pharmacol， 2005， 3(1):63-68.

　　［7］GonzalezQuesada C， Frangogiannis NG. Monocyte chemoattractant protein1/CCL2 as a biomarker in acute coronary syndromes ［J］. Curr Atheroscler Rep， 2009， 11(2):131-138.

　　［8］de Lemos JA， Morrow DA， Sabatine MS， et al. Association between plasma levels of monocyte chemoattractant protein1 and longterm clinical outcomes in patients with acute coronary syndromes ［J］. Circulation， 2003， 107(5): 690-695.