真核表达质粒pIRES2eGFPAnnexin A2的构建及其在293T细胞中的表达

　　　　作者：李娜， 周红 俞颖， 王婷 黄宏亮， 石文霞 王海波

【摘要】 目的： 构建含有人Annexin A2基因的真核表达质粒pIRES2eGFPAnnexin A2，并在真核细胞293T中表达。 方法： 将质粒pCMV5Annexin A2上Annexin A2基因酶切后与真核表达质粒pIRES2eGFP连接，酶切鉴定及测序正确后，脂质体介导法转染293T细胞，荧光定量PCR及蛋白质印迹法检测其基因和蛋白的表达。 结果： 构建的质粒pIRES2eGFPAnnexin A2转染293T细胞后，目的基因mRNA和蛋白表达均明显增高。 结论： 成功构建pIRES2eGFPAnnexin A2质粒并表达蛋白，为研究Annexin A2的生物学功能奠定了基础。

【关键词】 Annexin A2； 真核表达； 抗磷脂综合征

　　［Abstract］ Objective: To construct pIRES2eGFPAnnexin A2 eukaryotic expression vector carrying human Annexin A2 gene and express Annexin A2 protein in 293T cell.Methods： Annexin A2 gene digested from pCMV5Annexin A2 was ligated into eukaryotic expression vector pIRES2eGFP.After restriction analysis and sequencing， the recombinant plasmid pIRES2eGFPAnnexin A2 was transfected into 293T cells in the mediation of liposome.The expression of Annexin A2 was analyzed by western blot and realtime PCR. Results： The expression of Annexin A2 at both mRNA and protein levels were significantly increased when transfected with pIRES2eGFPAnnexin A2 in 293T cells. Conclusion： The eukaryotic expression vector pIRES2eGFPAnnexin A2 was correctly constructed and the Annexin A2 protein was successfully expressed in 293T cells.This will facilitate the following study on Annexin A2.

　　［Key words］ Annexin A2; eukaryotic expression； antiphospholipid syndrome

　　Annexins是一类钙依赖的膜磷脂结合蛋白，脊椎动物细胞的Annexins被命名为Annexin A 家族。其中Annexin A2由339个氨基酸组成，分子量36 kDa，主要表达于人单核细胞、内皮细胞和一些肿瘤细胞中，在细胞的膜形成、膜聚合、胞吞和胞吐中发挥功能。细胞膜上Annexin A2可作为多种蛋白的受体，在感染发生、肿瘤迁移、血凝和纤溶过程中起着重要作用。研究表明，它可作为纤溶酶原及组织纤溶酶原激活物的共同受体，介导纤溶酶的生成，有利于纤维蛋白的降解，维持纤溶的内稳态［1-3］。最近的研究发现，Annexin A2异源四聚体可介导纤溶酶与单核细胞结合，传递下游信号，引起趋化作用和炎性介质释放，与慢性炎症的发生发展有关［4］。

　　本小组的研究提示［5］，Annexin A2在抗磷脂抗体引发的血栓形成中起着重要作用，它可能作为抗磷脂抗体与磷脂结合蛋白复合物的受体，介导下游信号，引起血栓形成。本实验旨在构建真核表达质粒pIRES2eGFPAnnexin A2，并在293T细胞中表达目的蛋白，为进一步研究Annexin A2在抗磷脂综合征中的作用奠定基础。

1 材料与方法

　　1.1 材 料

　　DMEM及optiMEM培养基购于美国Gibco公司。胎牛血清购于兰州民海生物工程有限公司。逆转录试剂盒购于日本Toyobo公司。rTaq DNA聚合酶、dNTP、限制性核酸内切酶、DL2000，Sybergreen，1 kb DNA分子质量标准参照物均购于日本Takara Biotec公司。质粒抽提试剂盒购于美国Axygen公司。Trizol及LipofectamineTM2000购于美国Invotrigen公司。单克隆鼠抗人Annexin A2抗体购于美国Diagnostica公司。生物素化的兔抗鼠IgG购于美国Sigma公司。ECL显色试剂购于Santa Cruz（Europe）公司。真核表达载体pIRES2eGFP，293T细胞由本室保存。质粒pCMV5Annexin A2由美国McCrae K教授惠赠。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 pIRES2eGFPAnnexin A2载体构建 将含Annexin A2基因的真核表达质粒pCMV5Annexin A2及载体pIRES2eGFP分别用Sal Ⅰ，bgl Ⅱ 双酶切（37 ℃，2 h），酶切产物10%琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下切胶回收。回收后的目的基因Annexin A2和载体pIRES2eGFP以摩尔浓度3∶1的比例混合，T4DNA连接酶16 ℃过夜进行黏性末端定向连接。次日将5 μl连接产物用热休克法转化感受态E.coli DH5a菌。转化产物涂于LB平板（含100 g/ml卡那霉素），待液体吸收后，37 ℃培养过夜。挑取单个菌落至3 ml LB培养基（含100 g/ml卡那霉素）中，37 ℃增菌过夜。次日提取重组质粒进行酶切鉴定，阳性质粒送上海英骏生物技术有限公司测序。

　　1.2.2 转染293T细胞 转染前24 h胰酶消化293T细胞并种入六孔板内，待细胞生长至60 % ～ 80 %汇合，换无血清DMEM培养基。将4 g阳性质粒pIRES2eGFPAnnexin A2，4 g对照质粒pIRES2eGFP及5 μl LipofectamineTM2000分别稀释于250 μl optiMEM中，轻轻混匀，静置5 min，将250 μl LipofectamineTM2000稀释液滴加到250 μl DNA稀释液中，边滴加边混匀，室温静置20 min。然后每孔加入500 μl LipofectamineTM2000 /DNA复合物，并轻轻摇动使均匀混合。37 ℃，5% CO2培养箱培养4 h后换液。24 h后荧光显微镜下观察转染效率。

　　1.2.3 实时定量荧光PCR检测 采用Trizol试剂从上述转染pIRES2eGFPAnnexin A2及对照质粒24 h的293T细胞中提取总RNA并逆转录成cDNA。分别设计Annexin A2和GAPDH（内参）基因的引物进行相应基因的扩增，其序列为(5′3′)：Annexin A2：正义链为ACCTGGAGACGGTGATTT，反义链为TGCTCTTCTACCCTTTGC，扩增长度260 bp；GAPDH：正义链为GGATTTGGTCGTATTGGG，反义链为GGAAGATGGTGATGGGATT，扩增长度205 bp。定量PCR反应体系为：2.5 μl 10×PCR缓冲液，0.5 μl cDNA模板，2.0 μl dNTPs(25 mmol/L)，2.0 μl MgCl2(25 mmol/L)，上下游引物各0.5 μl(10 pmol/L)，rTaq聚合酶0.2 μl(5 U/μl)， SybergreenⅠ(1∶1000) 1 μl，用灭菌ddh3O补足至25 μl。PCR循环参数为： 94℃ 30 s，56 ℃(Annexin A2)/56℃(GAPDH) 30 s，72℃ 30 s，35个循环扩增。以Annexin A2与GAPDH mRNA比值记录结果。

　　1.2.4 蛋白质印迹分析 收集上述转染pIRES2eGFPAnnexin A2及对照质粒36 h的293T细胞膜裂解物，测定蛋白含量，取蛋白总量20 μg进行SDSPAGE （12 %）电泳，恒流（350 mA，2 h）转至PVDF膜上，置5 %的TBS/T牛奶中，37 ℃封闭1 h。 5 %的TBS/T洗涤后置单克隆鼠抗人 Annexin A2（1∶1 000）抗体中 4 ℃孵育过夜，次日洗涤，HRP羊抗鼠 IgG 抗体（1∶5 000） 37℃孵育1 h，洗涤3次后用ECL显色系统定影显色，观察杂交条带。

　　1.2.5 统计学分析 采用 SPSS(Version 10.0)，数据以(±s)表示。对各组数据进行成组t检验，P&<0.05具有统计学意义。

2 结 果

　　2.1 质粒pCMV5Annexin A2及pIRES2eGFP酶切结果

　　用SalⅠ，bglⅡ双酶切质粒pCMV5Annexin A2，电泳后可见在1.1 kb处有目的基因条带，证实得到Annexin A2的基因片段，可与酶切后的载体pIRES2eGFP （5.2 kb）连接（图1）。

　　2.2 Annexin A2表达载体的鉴定

　　阳性克隆酶切鉴定显示目的片段大小与预期相符。经测序后显示目的序列与NBCI（NM004039）相应序列完全相符（结果未显示）。证实载体构建成功，命名为pIRES2eGFPAnnexin A2（图2）。

　　2.3 Annexin A2在293T细胞中的表达

　　2.3.1 转染效率 在荧光显微镜下，观察转染pIRES2eGFPAnnexin A2及pIRES2eGFP质粒的293T细胞eGFP蛋白表达，初步推断转染效率。结果显示：转染24 h后可见细胞显示强绿色荧光，转染效率达到80 %以上（图3），72 h后荧光逐渐减弱。

　　2.3.2 转染后细胞Annexin A2 mRNA水平 如图4所示，与转染pIRES2eGFP质粒（对照空质粒）及未转染目的基因的293T细胞相比，转染pIRES2eGFPAnnexin A2质粒后239T细胞Annexin A2的mRNA水平明显增高（P&<0.05）。

　　2.3.3 转染后细胞Annexin A2蛋白表达 图5显示转染目的基因后239T细胞Annexin A2蛋白表达的变化。

　　结果表明，与未转染的293T细胞及转染pIRES2eGFP质粒的293T细胞比较，转染目的基因36 h后，293T细胞表达Annexin A2蛋白增加。

3 讨 论

　　前期研究中我们发现抗磷脂抗体能够刺激血液单核细胞表达组织因子（tissue factor，TF）活性，拮抗型抗Annexin A2抗体可抑制此过程，提示Annexin A2在抗磷脂抗体诱导的单核细胞TF表达过程中起重要作用［6］。为进一步探讨Annexin A2与抗β2GPI/β2 GPI复合物的关系，本实验构建真核表达质粒pIRES2eGFPAnnexin A2，脂质体介导转染293T细胞，使其高表达Annexin A2蛋白。就转染方法而言，脂质体介导的细胞转染操作简单， 转染效率高，重复性好，脂质体与DNA的结合不受DNA片段大小限制，脂质体/DNA复合物被吞入细胞后脂质体快速降解，不激活癌基因和免疫反应，与其他基因转移技术相比有更大的优势。但脂质体对细胞有一定毒性，为达到最佳转染效果，必须优化条件。本实验通过对比发现：细胞密度60%～80%，DNA与脂质体的质量体积比为4∶5时转染效率最高；脂质体/DNA复合物加入4 h后即更换新鲜培养基对细胞损伤较小。eGFP是GFP的突变体，在450～490 nm蓝光激发下能发出稳定的绿色荧光，荧光强度较GFP增加数十倍，灵敏度高且无细胞毒性，方便观察。pIRES2eGFPAnnexin A2以eGFP为报告基因，转入细胞后通过荧光显微镜观察eGFP表达情况，可方便快速地检测质粒的转染效率，利于后续实验，同时也为获得稳定的转染细胞株提供了基础。　 293T细胞作为工具细胞广泛用于基因转染实验中，本实验发现293T细胞具有极低量的Annexin A2基础表达。转染pIRES2eGFPAnnexin A2后，293T细胞的Annexin A2 mRNA及蛋白表达均显著增加，高于基础表达的6～7倍，能够满足于进一步的实验需要。

　　综上所述，本次实验成功构建了带有Annexin A2基因的真核表达质粒pIRES2eGFPAnnexin A2，高效转染293T细胞并检测到Annexin A2基因及蛋白表达，为下一步研究其与β2 GPI的相互作用，及在抗磷脂综合征病理机制中的作用奠定了基础。　　（本文图3见封三）

参考文献

［1］ Kim J， Hajjar KA.Annexin Ⅱ: a plasminogenplasminogen activator coreceptor［J］.Front Biosci， 2002， 7(2): D341-D348.

［2］ Ling Q， Jacovina AT， Deora A， et al.Annexin Ⅱ regulates fibrin homeostasis and neoangiogenesis in vivo［J］.J Clin Invest， 2004， 113(1): 38-48.

［3］ Roda O， Valero ML， Peiró S， et al.New insights into the tPAAnnexin A2 interaction. Is annexin A2 CYS8 the sole requirement for this association?［J］.J Biol Chem， 2003， 278(8): 5702-5709.

［4］ Laumonnier Y， Syrovets T， Burysek L， et al.Identification of the annexin A2 heterotetramer as a receptor for the plasmininduced signaling in human peripheral monocytes［J］.Blood， 2006， 107(4): 3342-3349.

［5］ 王 婷，周 红，俞 颖，等.抗β2 糖蛋白Ⅰ抗体诱导血液单核细胞表达组织因子活性的机制探讨［J］.江苏大学学报:医学版， 2006， 16(1): 1-4.

［6］ Zhou H， Ling S， Yu Y， et al.Involvement of annexin A2 in antiβ2GPI/β2GPIinduced tissue factor expression on monocytes［J］.Cell Research，2007，17(8): 737-739.