糜酶抑制剂对大鼠肺纤维化的干预作用及对血管紧张肽Ⅱ及其受体的影响

　　　　 作者：顾燕兰， 郑金旭， 万兵， 管淑红

【摘要】 目的： 观察糜酶抑制剂（ChyI）对博莱霉素（BLM）致大鼠肺纤维化模型的干预作用和对血管紧张肽Ⅱ及其受体的影响，探讨糜酶参与肺纤维化的机制。方法： 健康SD大鼠60只随机分3组：正常对照组（生理盐水），模型组（博莱霉素），干预组（博莱霉素＋糜酶抑制剂）。分别在第7，14，21，28天，每组HE染色5只大鼠，观察支气管肺组织病理改变，免疫组化观察肺组织中血管紧张肽Ⅱ及其受体的表达。结果： （1）肺泡炎程度评价：干预组和模型组与对照组间比较，差异有统计学意义，但干预组和模型组间差异无统计学意义。（2）肺纤维化程度评价：干预组和模型组与对照组间差异有统计学意义，且干预组和模型组之间比较，差异亦有统计学意义。（3）血管紧张肽Ⅱ及其受体的表达分析：模型组肺间质中血管紧张肽Ⅱ及其受体表达均持续增强，干预组均明显减少。结论： 糜酶抑制剂能减轻博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化，可能是通过下调血管紧张肽Ⅱ及其1型受体(AT1)的表达而起作用。

【关键词】 肺纤维化； 糜酶； 血管紧张肽Ⅱ

　　［Abstract］ Objective: To study the effect of chymase inhibitor on bleomycininduced pulmonary fibrosis in rats and its possible mechanism. Methods： Sixty female rats were randomly pided into three groups: the model group， the control group and the chymase inhibitor treatment group， in which the rats were intratracheally instilled with(5mg/kg) bleomycin. From the first day after bleomycin challenge， by every day， the chymase inhibitor treatment group was perfused intostomach daily chymase inhibitor(10 mg/kg)， the other group were given sterile saline. Five rats were killed each group respectively at the time of the seventh day， the fourteenth day， the twentyfirst day and the twentyeighth day. The pathological changes of lung tissue by hematoxylineosin staining were investigated. The expression of angiotensinⅡ， AT1 receptor in bronchial lung tisusue were examined by immunohistochemical analysis. Results： Alveolitis in the model group and the ChyI group were significantly lower as compared with the control， but there were no significant difference between the model group and ChyI group. Level of pulmonary fibrosis was inhibited evidently after the treatment by chymase inhibitor. The expression of angiotensin Ⅱ， AT1receptor，in the lung fibrosis of BLM group was higher than in control group with significant difference， and treatment group was lower than BLM group with significant difference. Conclusion： Chymase inhibitor can alleviate BLM induced pulmonary fibrosis in rat，inhibiting the expression of angiotensinⅡ，and AT1receptor in lung tissue may be one of the mechanisms.

　　［Key words］ pulmonary fibrosis; chymase; angiotensinⅡ
　　
　　肺纤维化的发生过程极其复杂，是由众多细胞和炎性介质参与、引起的网络调控式炎症反应。有关肺纤维化的发生机制多数不明，目前认为肺局部的血管紧张肽原酶－血管紧张肽－醛固酮系统(renninangiotensinaldosterone system， RAAS)与组织器官纤维化和（或）结构重构过程有密切关系［1］。Urata等［2］报道人类心脏存在双重的血管紧张肽Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）生成途径，ACE途径生成的AngⅡ仅占小部分（约11%），而另一种糜酶途径生成的AngⅡ却占绝大部分（约80%）。由此对生成AngⅡ的非血管紧张肽转换酶（angiotensinⅡconverting engyme，ACE）途径有了初步的认识，从而揭开了人类研究糜酶的序幕。
　　
　　本研究通过给予肺纤维化模型的SD大鼠糜酶抑制剂干预，检测AngⅡ及其受体(AT1)表达，探讨糜酶参与肺纤维化的机制及其与AngⅡ和其受体(AT1)的关系，为临床治疗肺纤维化提供新的思路。
　　
　　1 材料与方法

　　1.1 材 料
　　
　　博莱霉素（bleomycin， BLM）购自日本化学株式会社，使用时以生理盐水配成5 mg/kg；糜酶抑制剂购自南京大冶生物科技有限公司；兔抗大鼠的血管紧张素Ⅱ及其AT1的抗体、DAB试剂均购自武汉博士德生物有限公司；生物素化羊抗大鼠IgG购自上海华美生物公司。
　　
　　1.2 肺纤维化动物模型的建立与处置
　　
　　健康SD雌性大鼠60 只(购自江苏大学医学院动物中心)，体质量180 ～220 g，随机分为对照组（生理盐水），模型组（博莱霉素＋生理盐水），干预治疗组（博莱霉素＋糜酶抑制剂），每组各20只。
　　 　
　　采用腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg）麻醉大鼠后，无菌行颈部正中切开，逐层分离显露气管，模型组与干预治疗组气管内注入博莱霉素5 mg/kg 0.2 ～0.3 ml，随即将大鼠直立旋转，使肺内药物分布均匀。对照组以同样的方法气管内注入等量生理盐水，干预组第1天起至第28天，每日给予糜酶抑制剂5 mg/kg灌胃。
　　
　　3组动物于第7，14，21，28 天各随机处死5只，取左中肺叶置于4 %低聚甲醛中固定并作石蜡切片， 免疫组化光学显微镜检查 AngⅡ，AT1受体的表达，苏木精－伊红HE染色。
　　
　　1.3 免疫组织染色
　　
　　石蜡切片经常规脱蜡，脱水，自来水冲洗，用双蒸水洗3 次，抗原修复液煮沸10 min，保温20 min，自然冷却，滴加一抗（1∶200稀释）30 μl过夜孵育，再用PBS液洗脱后滴加二抗1滴保持于30 ℃恒温下1 h，PAS洗脱后行DAB显色，显色时间5～10 min，用蒸馏水洗3次，再行HE染色，二甲苯透明后用中性树脂封固。在稳压条件下，以高倍镜(×400)在整张切片上分别计数阳性细胞，阳性细胞数在0～10％为(－)，10％～25％为轻度(+)，25％～50％为中度(++)，50％～75％为重度(+++)，75％～100％为重度以上，分别以0，1，2，3，4表示，将其转化为计量资料。
　　
　　1.4 统计学处理
　　
　　采用SPSS11.5软件，各组数据以±s表示；组间比较采用单因素方差分析，多个样本之间的两两比较采用SNK检验， P&<0.05为差异有统计学意义。
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 病理学检查
　　
　　模型组与治疗组病理变化有同一规律:灌注BLM后第7天肺泡炎明显，肺泡腔内可见大量炎性细胞渗出，成纤维细胞增殖，毛细血管增生，病灶内肺泡萎陷。第14天肺泡炎逐渐减轻，肺泡壁增厚，肺纤维组织增生，肺泡间隔明显增宽。第21，28天肺泡炎不明显，肺纤维化程度加重，肺泡结构破坏，肺泡腔明显缩小。光镜观察对照组各观察点均无明显病变，干预组大鼠肺泡炎与模型组无明显变化，但肺纤维化发生率明显降低，且程度轻，无严重肺纤维化发生，如图1。
　　
　　模型组、干预组早期肺泡炎和晚期肺纤维化均与对照组有明显的统计学差异(P&<0.01，P&<0.05)，干预组肺泡炎与模型组差异无统计学意义，但肺纤维化两组差异有统计学意义(P&<0.01)，如表1，表2。

　　表1 各组大鼠肺泡炎程度比较（略）

　　Tab 1 Extent of alveolitis in the experimental rats（略）

　　a：P&<0.01; b：P&<0.05; c：P&<0.05，与对照组比较

　　表2 各组大鼠肺纤维化程度比较（略）

　　Tab 2 Extent of pulmonary fibrosis in the experimental rats（略）

　　 a:P&<0.01， b：P&<0.01，与对照组比较；c：P&<0.01，与模型组比较

　　2.2 血管紧张肽Ⅱ
　　对照组血管紧张肽Ⅱ在肺泡上皮细胞、血管内皮细胞的胞质呈现弱表达，模型组中在肺泡上皮细胞、肺泡巨噬细胞、血管内皮细胞胞质里强表达，与对照组相比有统计学差异(P&<0.01)，干预组表达较模型组表达弱，有统计学差异(P&<0.01， P&<0.05)，见表3。
　　
　　表3 各组大鼠4个时间点肺组织中血管紧张肽Ⅱ含量比较（略）

　　Tab 3 Angiotensin Ⅱ protein expression level in each group

　　a：P&<0.01，b：P&<0.01，与对照组比较；c：P&<0.01，d：P&<0.05，与模型组比较

　　2.3 血管紧张肽Ⅱ受体免疫组化结果
　　
　　血管紧张肽Ⅱ受体在对照组的肺泡上皮细胞、血管内皮细胞胞膜上表达弱，模型组则强表达，两组比较差异有统计学意义(P&<0.01)。干预组表达较模型组弱，差异有统计学意义(P&<0.01，P&<0.05)，见表4。
　　
　　表4 各组大鼠4个时间点肺组织中血管紧张素Ⅱ受体AT1含量结果比较（略）

　　Tab 4 AT1receptor protein expression level in each group

　　a:P&<0.01，与对照组比较； b：P&<0.01，c:P&<0.05，与对照组比较；d：P&<0.01，e：P&<0.05，与干预组比较
　　
　　3 讨论
　　
　　血管紧张肽原酶－血管紧张肽－醛固酮系统（RAAS）主要由两个酶(血管紧张肽原酶和血管紧张肽转化酶) 、一个底物(血管紧张肽原) 和若干产物组成。血管紧张肽原酶可催化血管紧张肽原转化为血管紧张肽Ⅰ(angiotensinⅠ， AngⅠ)，AngⅠ被血管紧张肽转换酶(angiotensin converting enzyme， ACE) 降解为血管紧张肽Ⅱ(angiotensinⅡ， AngⅡ)。在人类， 应用选择性拮抗剂发现AngⅡ受体有两种亚型: AT1 和AT2。AT1 受体广泛分布于所有的组织器官， 如肝、肺、肾、心肌组织、大脑、血管壁等。AT2广泛分布于胚胎组织， 在出生后表达迅速减少。AT1受体介导了AngⅡ的绝大部分作用， 包括平滑肌细胞收缩、醛固酮分泌、体液调节以及细胞生长增殖［3］。所谓局部RAAS是指局部微循环中存在血管紧张肽的合成，并不依赖于血循环中的RAAS，而是一个独立的系统，通过自分泌或旁分泌发挥作用，并有细胞表达相应的受体，与组织纤维化的发生、发展密切相关［4］。
　　
　　AngⅡ及其受体在肺纤维化形成中的作用已有报道［5-7］，通过AngⅡ的自分泌合成并与AT1 结合诱导肺泡上皮细胞凋亡从而促进肺纤维化的形成。Wang 等［8］在肺损伤修复以及随后的纤维化过程实验中常可观察到肺泡上皮细胞、淋巴细胞、巨噬细胞以及其他实质细胞的凋亡。研究显示，诱导肺泡上皮细胞凋亡的物质是血管紧张肽的肽段。Wang 等［9］又进一步证实此凋亡是通过Fas途径介导的。重组人Fas配体、肿瘤坏死因子(TNF) 和博莱霉素可以诱导肺泡上皮细胞凋亡，均与血管紧张肽的mRNA 大量表达有关。另有报道表明［10］， 应用紧张肽受体拮抗剂（angiotensin receptor antagonist，ABR）氯沙坦， 或剔除C57BLP6J 小鼠AT1基因，可以抑制博莱霉素引起的肺泡上皮细胞凋亡和纤维化。Richard 等［11］在体外实验中用免疫组化法研究AngⅡ分别促进胎儿和成人肺组织成纤维细胞增殖的能力， 结果表明AngⅡ能促进成纤维细胞的有丝分裂，DNA 合成显著增加， 胎儿和成人成纤维细胞分别增长（211±18）%和（150±14）%， 而血管紧张肽转化酶抑制剂ACEI、血管紧张肽受体拮抗剂ARB可以阻断此环节。
　　
　　研究表明在局部RAAS中，不是ACE起主要的作用，而是糜酶发挥关键作用［2］。糜酶主要存在于肥大细胞，当有炎症等刺激时肥大细胞即脱颗粒， 糜酶被释放到细胞外。它在细胞外使Ang Ⅰ转换成AngⅡ，而AngⅡ促肺纤维化作用上面已描述了。心脏间质中糜酶一方面通过催化生成的AngⅡ刺激醛固酮分泌， 促进胶原合成， 另一方面还能直接水解前胶原酶， 生成具有生物活性的胶原酶， 调控间质胶原代谢［5-7］。 有关糜酶在肺纤维化中作用的研究不多，Sakaguchi等［12］用博莱霉素造模，用糜酶抑制剂NK3201干预，结果显示干预组比造模组糜酶活性下降，肺纤维化程度也减轻。在百草枯诱发肺炎和纤维化的仓鼠模型的实验研究中，Orito等［13］解剖急、慢性百草枯中毒群鼠，发现慢性中毒鼠的肺组织发生纤维化，与对照组相比，急慢性百草枯中毒组肺组织的糜酶活性增加而ACE活性降低。
　　
　　本实验用糜酶抑制剂（ChyⅡ）对博莱霉素致肺纤维化模型大鼠进行灌胃，用HE染色的方法观察3组动物第7，14，21，28天4个时间段的病理变化，用免疫组化的方法观察这3组大鼠4个时间段的血管紧张素Ⅱ及其受体AT1的变化。试验结果表明：（1）糜酶抑制剂不能减轻博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化模型肺泡炎，但能够减轻肺纤维化。（2）肺纤维化大鼠模型中，血管紧张肽Ⅱ和其受体表达有上调，糜酶抑制剂可以减轻肺纤维化，并在肺组织中观察到血管紧张肽Ⅱ和其AT1受体表达比模型组减少。说明血管紧张肽Ⅱ和其受体参与了肺纤维化机制，糜酶抑制剂是部分通过下调血管紧张肽Ⅱ和其AT1受体表达来抑制肺纤维化。本研究虽然还处于初步阶段，但对深入探讨肺纤维化的发病机制和指导临床治疗肺纤维化具有一定的意义。
　　
　　（本文图1见彩色插图）（略）

参考文献

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