非小细胞肺癌组织MIP1表达及其与树突状细胞浸润的关系

　　　　 作者：陈宇平， 穆传勇， 翁根龙， 宋丽丽， 黄建安

【摘要】 目的： 探讨巨噬细胞炎症蛋白1（MIP1）在非小细胞肺癌组织中的表达与肿瘤浸润树突状细胞之间的关系。方法： 经外科手术切除的60例非小细胞肺癌组织标本，分别采用免疫组织化学检测趋化因子受体CCR1，CCR7的表达，荧光原位杂交法检测MIP1的表达。结果： （1）肺癌细胞胞质及胞膜表达MIP1，同时检测到肺癌组织中有CCR1和CCR7阳性树突状细胞的浸润。（2）肺癌组织中CCR1，CCR7及MIP1表达和肺癌临床分期、淋巴结转移有关，和病理类型、分化程度无关。有淋巴结转移组表达MIP1的肿瘤细胞及CCR1阳性树突状细胞数量明显高于无淋巴结转移组（P＜0.05），Ⅲ～Ⅳ期患者表达MIP1的肿瘤细胞及CCR1阳性树突状细胞数量明显高于Ⅰ～Ⅱ期（P＜0.05）。（3）肺癌组织中MIP1阳性细胞表达率和CCR1阳性树突状细胞数量呈正相关，和CCR7阳性树突状细胞数量呈负相关（P＜0.05）。结论： 非小细胞肺癌组织MIP1表达和肺癌临床分期及淋巴结转移有关，与肿瘤浸润树突状细胞表面分子CCR1，CCR7的表达关系密切，推测MIP1可能影响肿瘤浸润树突状细胞的发育和趋化功能并参与肺癌的免疫逃逸和疾病进展。

【关键词】 非小细胞肺癌； 巨噬细胞炎症蛋白1； CCR1； CCR7

　　［Abstract］ Objective: To explore the relationship of dendritic cell infiltration and MIP1 expression in nonsmall cell lung cancer(NSCLC) and its clinical significance.Methods： Immunohistochemical staining was performed to detect expression of CCR1，CCR7，and fluorescent in situ hybridization performed to detect expression of MIP1 in 60 lung cancer tissues. Results： （1）MIP1 positive tumor cells and CCR1，CCR7 positive dendritic cells were detected in lung cancer tissues；（2）Expression rate of CCR1 and MIP1 with lymph node metastasis was higher than that without lymph node metastasis，and stage Ⅲ～Ⅳ were higher than those of stage Ⅰ～Ⅱ，all above differences were statistically significant（P＜0.05）；（4）The positive percentage of CCR1，CCR7 and MIP1 had no relationship with pathological type and cell differentiation（P&>0.05）， but was correlated with clinical stage and lymph node metastases（P＜0.05）；The expression levels of MIP1 of lung cancer were positive correlation with the percentage of CCR1 positive dendritic cells（P＜0.05）and negative correlation with the percentage of CCR7 positive dendritic cells（P＜0.05）. Conclusion： The expression of MIP1 is related to lymph node metastasis and clinical stage of lung cancer.MIP1 may play an important role of tumor immune escape and progression of disease through interfering cell differentiation of TIDC.

　　［Key words］ nonsmall cell lung cancer； macrophage inflammatory protein1; CCR7； CCR1

　　趋化因子及其受体广泛参与机体细胞生长、分化、凋亡、组织损伤，其与肿瘤的发生发展之间的关系也是近年来的研究热点。我们通过研究肺癌组织的巨噬细胞炎性蛋白1（MIP1）表达与肺癌组织中浸润树突状细胞表面趋化因子受体CCR1，CCR7表达的关系，初步探讨肺癌的免疫逃逸机制。

1 材料和方法

　　1.1 材 料

　　随机选取2004年11月～2007年9月吴江市第三人民医院及苏州大学附属第一医院胸外科手术治疗的60例非小细胞肺癌组织作为研究对象，标本均经过病理诊断证实，患者术前均未行放疗或化疗。60例肺癌患者中男44例，女16例，年龄35～72岁，平均（53.9±8）岁。根据1997年国际抗癌联盟(UICC)修订的标准进行TNM分期：Ⅰ期9例，Ⅱ期27例，Ⅲ期21例（ⅢA期16例，ⅢB期5例），Ⅳ期3例。组织学分级：高分化6例，中分化35例，低分化19例。病理类型：鳞癌28例，腺癌22例，大细胞癌6例，其他类型4例。送检区域淋巴结癌转移阳性者25例，阴性者35例。

　　1.2 试 剂

　　CCR1，CCR7多克隆抗体、免疫组化SP检测试剂盒及MIP1原位杂交检测试剂盒均购自武汉博士德生物制品公司。针对人MIPl 靶基因的mRNA序列为：① 5′TGCCCTTGCTGTTCTTCTCTGCACCATGGC3′;② 5′GGCAAATTCCACGAAAATTCATTGCTGACT3′ 。

　　1.3 方 法

　　1.3.1 免疫组织化学 所有标本均经10%的中性甲醛固定，常规石蜡包埋， 5 μm切片，二甲苯及梯度乙醇脱蜡至水，抗原微波修复，3％h3O2阻断内源性过氧化物酶，PBS洗涤，山羊血清封闭后加入抗CCR7多克隆抗体， 4℃过夜，PBS洗涤后依次加入二抗及卵白素过氧化物酶，DAB显色。操作严格按产品说明书进行，滴加PBS液代替一抗作阴性对照。

　　1.3.2 荧光原位杂交 MIP1原位杂交检测按博士德公司说明书操作。切片脱蜡至水化，3％h3O2室温下处理10 min，蒸馏水冲洗，切片上滴加3％柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶消化液，37℃消化15 min显露mRNA核酸片段，原位杂交用PBS冲洗，然后蒸馏水冲洗后固定，1％低聚甲醛，0.1 mmol/L PBS，含有1/1 000 DEPC，室温固定10 min，蒸馏水冲洗。预杂交，每张切片加20 μl预杂交液，放湿盒内置38℃恒温箱内3 h，吸取多余液体，不洗。杂交，按每张切片加20 μl杂交液，加盖原位杂交专用盖玻片，放湿盒内置于38℃恒温箱内杂交过夜。杂交后洗涤，揭去盖玻片，37℃的2×SSC洗脱液洗2 min×2次，0.5×SSC洗涤2 min×1次，0.2×SSC洗涤15 min×1次。滴加封闭液37℃孵育30 min，倾去多余液体，滴加生物素化鼠抗地高辛，37℃ 60 min，原位杂交用PBS冲洗。滴加SABC 37℃ 20 min，原位杂交用PBS冲洗。滴加生物素化过氧化物酶，37℃ 20 min或室温30 min，PBS冲洗。加荧光素标记的二抗，荧光显微镜下计数阳性细胞。

　　1.4 免疫组化及荧光原位杂交染色结果判断

　　免疫组化染色阳性细胞均为胞质或胞膜染成棕黄色或棕褐色。荧光显微镜下观察胞质中出现亮绿色荧光颗粒为MIP1阳性，阴性细胞均不染色。随机计数5个高倍视野的阳性细胞数目，以每高倍视野平均值作为划分界限，染色＞5％判读为阳性表达。

　　1.5 统计学方法

　　统计数据采用χ2检验及Fisher精确检验，所有结果经过SPSS11.5软件包进行统计分析，P&<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

　　2.1 肺癌组织中MIP1表达

　　癌旁肺组织中无MIP1阳性染色细胞，而肺癌组织中可见到胞膜或胞质有绿色荧光物质表达（图1）。2.2 肺癌组织中CCR1，CCR7表达

　　肺癌组织中可以见到棕黄色或棕褐色的阳性染色的肿瘤浸润树突状细胞，形态不规则，表面有较多突起。部分切片可见到少许核大、胞质丰富形态较规则的肿瘤细胞，和树突状细胞形态明显不同。见图2。

　　2.3 肺癌组织中MIP1表达、树突状细胞浸润与肺癌临床病理特征的关系

　　MIP1阳性肿瘤细胞的数量与肺癌病理类型、分化程度无关，和肺癌分期、淋巴结转移相关，Ⅲ～Ⅳ期肺癌组织中MIP1阳性肿瘤细胞数量明显多于Ⅰ～Ⅱ期，有淋巴结转移组明显多于无淋巴结转移组，差异有统计学意义（P＜0.05）。CCR1和CCR7阳性树突状细胞的表达和病理类型和分化程度无关，和肺癌分期、淋巴结转移相关，Ⅲ～Ⅳ期肺癌组织中CCR1阳性树突状细胞数量明显多于Ⅰ～Ⅱ期，有淋巴结转移组的明显多于无淋巴结转移组；而Ⅲ～Ⅳ期肺癌组织中CCR7阳性树突状细胞数量明显少于Ⅰ～Ⅱ期，有淋巴结转移组的明显少于无淋巴结转移组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。表1 60例肺癌组织中MIP1及CCR1，CCR7阳性树突状细胞表达与肺癌临床病理特征的关系

　　2.4 肺癌组织MIP1与CCR1，CCR7阳性树突状细胞表达的关系

　　肺癌组织MIP1阳性表达组中CCR1阳性树突状细胞数量明显增多，两者呈正相关关系；而CCR7阳性细胞浸润数量明显减少，两者呈负相关关系（P＜0.05），见表2。表2 肺癌组织MIP1表达和CCR1，CCR7阳性树突状细胞表达情况

3 讨 论

　　趋化因子是当今国内外医学生物学研究的热点之一，其在胚胎发育、肿瘤、血管生成、炎症等机体多种生理和病理过程中发挥重要作用，近年来与肿瘤生物行为学的关系备受关注［1，2］。MIP1属趋化因子CC家族，是趋化因子受体CCR1的配体。在不同因素刺激下，MIP1可由多种细胞产生。有学者发现，MIP1在胃癌、卵巢癌等肿瘤细胞中有表达，并且表达水平与肿瘤的淋巴结转移有关，提示MIP1参与了肿瘤细胞的迁移［3，4］。本实验通过荧光免疫杂交法在肺癌组织中检测到MIP1的表达，而癌旁组织未发现MIP1表达，提示MIP1在肺癌的发生过程中起重要作用。进一步研究发现， MIP1阳性表达的肺癌患者淋巴结转移率较MIP1阴性表达的肺癌患者转移率高，提示MIP1表达可能促进肺癌发生淋巴结转移。有些学者认为，表达MIP1的肿瘤细胞发生转移的机会增加可能和肿瘤组织中浸润的树突状细胞有关，MIP1可通过抑制树突状细胞的成熟来削弱树突状细胞向肿瘤特异淋巴细胞递呈抗原的能力，从而抑制肿瘤的局部免疫反应［5-7］。

　　树突状细胞是一种强有力的抗原递呈细胞，通过其表面表达的趋化因子及受体在肿瘤局部作定向迁移，在抗肿瘤免疫中发挥重要作用。CCR1，CCR7是树突状细胞表面两个重要的标记分子，CCR1通常在未成熟树突状细胞的表面表达，通过与其配体MIP1的结合激发一系列生化反应，使树突状细胞骨架重组，形成伪足，与周围细胞的黏附性发生改变，便于细胞向信号所指引的方向游走，定位到肿瘤部位［8］。研究证实，未成熟树突状细胞不能有效地向T细胞递呈肿瘤抗原而导致免疫无能，甚至诱导机体的免疫耐受。CCR7表达于成熟的树突状细胞表面，通过与受体结合，协调众多趋化因子参与树突状细胞递呈抗原过程，启动免疫应答［9］。本研究发现，肺癌组织中可检测到表面表达CCR1及CCR7的树突状细胞，而且Ⅲ～Ⅳ期肺癌组织中树突状细胞CCR1阳性表达明显多于Ⅰ～Ⅱ期。进一步研究发现，MIP1阳性表达的肺癌组织中，CCR1阳性树突状细胞数量明显增多，统计学发现两者存在正相关，提示MIP1可能通过趋化功能吸引更多的未成熟树突状细胞到肿瘤局部，但这部分树突状细胞存在成熟障碍，并不具备抗原递呈功能，无法激发肿瘤特异杀伤性T细胞的活性甚至诱导产生无能T细胞。至于树突状细胞失活的原因目前有众多观点［10，11］，其中包括：表达MIP1的肿瘤细胞缺乏激活树突状细胞使其发挥生物学功能的刺激因子、肿瘤细胞通过释放某些细胞因子（如VEGF，IL10等）阻碍树突状细胞的分化和抗原递呈、CCR1与MIP1的结合活化了细胞间的信号转导和生物学效应，具体机制还有待于进一步的研究探讨。

参考文献

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