胸腔积液脱落细胞端粒酶逆转录酶mRNA检测及其意义

　　　　　　 作者：仇铁峰 陈萍 丁明 凌夏金

【摘要】 目的： 通过检测良、恶性胸腔积液脱落细胞端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的表达情况，探讨其在良、恶性胸腔积液中的诊断价值。方法： 采用逆转录多聚酶链反应法检测39 例恶性胸腔积液、16 例良性胸腔积液中hTERT基因的表达情况。结果： 恶性胸腔积液中hTERT基因的表达率明显高于良性胸腔积液(P&<0.05) 。检测hTERT基因表达对恶性胸腔积液的敏感性、特异性和诊断符合率分别为87.18%， 81.25%和 85.45%。结论： hTERT基因参与了恶性胸腔积液的发生、发展过程。采用RTPCR 法检测胸腔积液中hTERT基因表达有助于临床上良、恶性胸腔积液的鉴别诊断。

【关键词】 胸腔积液； 端粒酶逆转录酶； 逆转录多聚酶链反应法

　　［Abstract］ Objective: To investigate the diagnostic significance of the detection of the expression of human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene in benign and malignant pleural effusion.Methods： Telomerase hTERT gene expression of exfoliated cell in pleural effusion of 16 cases with benign pleural effusion and 39 cases with malignant pleural effusion were measured by RTPCR. Results： Telomerase hTERT gene expression of exfoliated cell in malignant pleural effusion was higher than that in benign pleural effusion(P&<0.05).The sensitivity， specificity and diagnostic accordance rate (%) of hTERT mRNA was 87.18%， 81.25% and 85.45%， respectively. Conclusion： Telomerase hTERT gene might involve in pathological process of malignant pleural effusion.The detection of telomerase hTERT gene by RTPCR is useful to diagnose and distinguish the benign and malignant of pleural effusion.

　　［Key words］ pleural effusion； human telomerase reverse transcriptase; RTPCR

　　许多疾病可伴有胸腔积液。 随着肿瘤发病率的上升， 恶性胸腔积液也显著增多。正确判断胸腔积液良、恶性质， 对于明确疾病诊断、制定治疗策略和判断预后都具有重要的临床意义。目前临床诊断恶性胸腔积液的金标准为脱落细胞学检查， 但是细胞学敏感性仅为40%～60%［1］，阳性率不能令人满意。端粒酶(telomerase)被公认为已知分布最广的肿瘤标记物，几乎在所有类型的肿瘤中均有不同程度的表达，而在大部分正常组织中基本不表达。人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase， hTERT) 是调节端粒酶活性的限速决定因子， 其表达变化与端粒酶活性密切相关［2］。因此，本研究采用逆转录多聚酶链反应（RTPCR）法检测胸腔积液中hTERT mRNA 的表达，探讨其在良、恶性胸腔积液临床鉴别诊断中的价值，以探索一条借助分子生物学手段提高胸腔积液诊断水平的新途径。

1 材料和方法

　　1.1 材 料

　　55 份胸腔积液标本来自55 例不同的患者，从江苏大学附属医院2003年2月～2007年6月间呼吸科住院和门诊患者中收集。所有标本均在首次胸腔穿刺的过程中留取。

　　根据临床最终诊断(脱落细胞学、胸膜活检、淋巴结穿刺和纤维支气管镜检查等)结果， 55 例患者分成良、恶性胸腔积液两组。恶性胸腔积液组：39 例患者，男性24 例，女性15 例，年龄38～89岁，平均年龄（60±13）岁。其中肺癌22 例，胸膜间皮瘤1例，食管癌2 例，肝癌1例，甲状腺癌1例，白血病 1例，卵巢癌1例，不明来源10例。经胸腔积液常规涂片脱落细胞学检查确诊的有15例。胸腔积液收集前患者均未行化疗和放疗。良性胸腔积液组：16 例患者，男性11例，女性5 例，年龄38～89岁，平均年龄（45±17）岁。其中结核性胸膜炎14例，心功能不全合并胸腔积液2 例。

　　1.2 主要试剂和仪器

　　人肿瘤细胞分离液比重约为1.055 g/ml，购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司。Trizol试剂、反转录试剂盒和PCR试剂为Invitrogen 公司产品。琼脂糖选用Promega公司产品。主要仪器包括日本SANYO公司MDF382E超低温冰箱、上海安亭科学仪器厂TDLS 台式低速离心机、上海市离心机械研究所IL16R 台式高速冷冻离心机、日本HITACHI公司U2800紫外分光光度计、美国BIORAD公司MyCycler PCR仪和全自动凝胶图像分析系统。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。　　

　　1.3 方 法

　　1.3.1 收集胸腔积液细胞 选取胸腔积液患者，抽取胸腔积液200 ml，加入枸橼酸钠抗凝，混匀。其中100 ml胸腔积液送病理室进行常规脱落细胞学检查，剩余的100 ml胸腔积液于4℃条件下离心20 min，收集细胞沉渣用PBS液混悬后，缓慢加至人肿瘤细胞分离液上， 20℃下2 000 r/min离心20 min。收集中间层细胞，-70℃保存，用于检测hTERT基因。

　　1.3.2 引物设计 引物用Primer软件自行设计。hTERT基因mRNA引物序列：上游 5′AAGTTCGTGGACTGGCTGAT3′，下游 5′GCACGACGTAGTCCATGTTC3′，扩增片段为294 bp。取GAPDH基因为内参，GAPDH基因mRNA引物序列：上游5′ATGACCACAGTCCATGCCAT3′， 下游5′TTCCTCTTGTGCTCTTGCTG3′，产物长度是526 bp。

　　1.3.3 细胞总RNA提取 应用Trizol试剂消化细胞，消化后用氯仿抽提，异丙醇沉淀总RNA，溶于DEPC水中。紫外分光光度仪测定总RNA的含量和RNA260/280比值。提取的总RAN-70℃冻存备用。

　　1.3.4 RTPCR操作 取细胞总RNA 2.0 μg，按反转录试剂盒说明书进行反转录反应。合成的cDNA置-20℃保存。每份标本均扩增GAPDH和hTERT。PCR反应体积为25 μl，反应终浓度为：1×缓冲液，200 μmol/L dNTP，1.5 mmol/L MgCl2，上下游引物0.4 μmol/L，cDNA 1μl， Taq DNA聚合酶0.5 U，用ddh3O补足体积至25 μl。PCR仪上94℃预变性5 min后，94℃变性30 s， 60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环，72℃再延伸10 min后4℃保存。

　　1.3.5 hTERT基因表达的判断 取10 μl PCR产物，在1.2%琼脂糖上电泳，EB染色后，紫外灯下观察结果，全自动凝胶成像系统拍照。同一份标本中，GAPDH和hTERT基因均有目标扩增条带，判断为该标本hTERT基因表达；如GAPDH有目标扩增条带，而hTERT基因没有目标扩增条带，则判断为该标本不表达hTERT基因。

　　1.4 统计学处理

　　本组资料为计数资料，所得数据使用SPSS 13.0统计软件、采用χ2检验和Fisher确切概率法进行统计学分析。P&<0.05为有统计学意义。

2 结 果

　　2.1 恶性和良性胸腔积液中hTERT mRNA的表达

　　所有标本均扩增出GAPDH基因目的条带，证实总RNA提取的完整性以及PCR反应是成功的。39例恶性胸腔积液患者中34例检测出hTERT基因表达（阳性率87.18%），16例良性胸腔积液患者中3例有hTERT基因表达（阳性率18.75%），恶性胸腔积液中hTERT的表达高于良性胸腔积液中的表达。经χ2检验分析，两组间差异有统计学意义（P&<0.05）。见图1～2。

　　M: DL2000标准参照物，从上到下依次为2000，1000，750，500，250，100 bp 1～3为良性胸腔积液，4～14为恶性胸腔积液。

　　2.2 hTERT mRNA的表达与恶性胸腔积液患者临床特征的关系

　　hTERT mRNA的表达和恶性胸腔积液患者年龄、性别、吸烟史和肿瘤来源无关。见表1。 表1 hTERT 表达和恶性胸腔积液患者临床特征的关系

　　2.3 hTERT mRNA的表达对恶性胸腔积液的诊断价值

　　55例胸腔积液标本中，hTERT mRNA表达阳性37例，阴性18例。对比临床最终诊断结果：真阳性34例，假阳性3例，真阴性13例，假阴性5例。诊断敏感性87.18%，特异性81.25%，诊断符合率为85.45%。

　　2.4 脱落细胞学诊断与 hTERT mRNA表达的关系

　　hTERT mRNA 表达阳性率在脱落细胞学诊断癌细胞组为100%(15/15)， 诊断疑癌或异型细胞组为91.67%(11/12)， 未见癌细胞组为66.67%(8/12) 。各组间差异比较有统计学意义（P=0.031）。

3 讨 论

　　胸腔积液发病机制复杂，良、恶性胸腔积液的鉴别有时比较困难。在我国这两类疾病的代表是结核性胸膜炎与癌性胸腔积液。目前诊断恶性胸腔积液主要依靠脱落细胞学检查， 但是由于受原发肿瘤的类型、部位及标本的收集和病理科医生读片经验的影响，其阳性率只有40%～60%［1］，因而尚不能完全满足临床诊断的需要。故寻找理想的肿瘤标志物一直是人们关心的研究课题。

　　有研究证实端粒酶是迄今为止最为广谱的肿瘤分子标志物，端粒酶的激活、端粒延长是大多数肿瘤发生的共同事件， 也是近年来备受人们关注的肿瘤发生发展机制之一［3］。端粒酶是一种RNA依赖的DNA多聚酶，其功能是以自身的RNA为模板，合成位于染色体末端的一段富含5′TTAGGG3′的特殊DNA序列，即端粒，以补偿细胞分裂过程中端粒的丢失，使细胞得以无限分裂。端粒酶的活化与肿瘤的发生、发展有密切关系。研究表明端粒酶在80 %～90 %的肿瘤细胞中呈高水平表达，而在正常体细胞中几乎检测不到［4］。人端粒酶由3个亚单位组成：人端粒酶RNA组分（hTERC）、人端粒酶相关蛋白1（hTEP1）和hTERT。在这3个亚单位中，用RTPCR 方法研究表明， hTERC和hTEP1呈组成性表达，它们在癌组织和正常组织均有95%～100 %的阳性表达， 仅hTERT的表达具有癌细胞特异性，且和端粒酶活性的激活相一致［5-7］。

　　hTERT基因位于染色体5p15.33，全长约40 kb，含16个外显子和15个内含子，外显子长度62～1 354个碱基不等，编码1 132个氨基酸组成的相对分子质量为127×103的蛋白质。hTERT能以hTERC为模板，合成端粒DNA并加到染色体末端， 延长端粒，维持染色体的稳定与基因组的稳定，从而延长细胞的寿命使细胞永生化。因此hTERT是调节端粒酶活性高低的限速决定因子。hTERT mRNA的表达上调将导致端粒酶活性升高，在细胞的增殖、分化和衰老以及肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用。Shay等［8］发现在约85%肿瘤细胞中检测到端粒酶活性的同时，在转录水平也能检测hTERT活性。Kolquist等［9］用原位杂交的方法在单细胞水平研究正常组织细胞和不同发生阶段肿瘤细胞中hTERT的表达情况，发现hTERT 的表达始于肺和结肠肿瘤发生的早期，在癌变过程中表达逐渐增加，抑制肿瘤细胞的hTERT会抑制肿瘤细胞的生长， 甚至引起细胞的凋亡。在大部分正常组织如肺脏、肝脏、胰腺、前列腺、膀胱、肾脏以及脑与尿道不表达hTERT mRNA。

　　我们采用RTPCR法，检测了39例恶性胸腔积液和16例良性胸腔积液脱落细胞中hTERT mRNA的表达情况。结果显示hTERT mRNA在恶性胸腔积液组中有高表达率，为87.18%，而良性胸腔积液组中只有3例（18%）检测到表达，两者相比，差异有统计学意义（P=0.000），表明hTERT mRNA表达是恶性胸腔积液发生和发展过程中的重要因素。

　　我们的研究显示，hTERT mRNA表达与恶性胸腔积液患者的年龄、性别、吸烟史无相关性，与恶性胸腔积液的肿瘤来源也无相关性。在胸部影像学检查阴性的17例肺外来源的恶性胸腔积液中，hTERT mRNA表达阳性率高达88.23%，说明 hTERT作为肿瘤分子标志物具有广谱性。提示临床上对胸部影像学检查阴性的胸腔积液患者，进行hTERT mRNA检测将有助于胸腔积液的诊断。

　　由于 hTERT mRNA表达是恶性胸腔积液发生发展过程中的重要因素，因此检测胸腔积液中hTERT mRNA表达有可能作为胸腔积液诊断和鉴别诊断的检查方法。本研究中，我们评价了检测 hTERT mRNA表达对恶性胸腔积液的诊断价值。结果表明，hTERT mRNA表达诊断恶性胸腔积液的敏感性为87.18%，特异性81.25%，诊断符合率达85.45%。因此hTERT具有良好的肿瘤特异性和敏感性，可作为胸腔积液诊断和鉴别诊断的肿瘤标志物。

　　胸腔积液中hTERT基因的RTPCR检测结果与传统的脱落细胞学结果比较，可以看出，hTERT mRNA阳性表达率在诊断为癌细胞组、疑癌或异型细胞组、未见癌细胞组间存在显著差异。 癌细胞组高于其他两组，阳性率为100%，结果与细胞病理检出结果一致。在疑癌或异型细胞组，hTERT mRNA阳性表达率高达91.67%。因此， 对于细胞学可疑癌细胞或异型细胞等难以明确诊断的病例， 借助 hTERT mRNA的检测， 如果结果阳性，则有助于确诊。未见癌细胞组hTERT mRNA表达阳性率也较高，达66.67%。恶性胸腔积液中未见癌细胞，除受原发肿瘤的类型、部位及标本的收集和病理科医生读片经验的影响外，也与传统细胞病理学诊断自身的客观局限性有关。人体细胞由正常到癌变， 其形态变化是一个渐进的过程， 并且常滞后于功能变化， 因此肉眼观察必然有一个难以确定的灰色区。对于这部分患者，进行hTERT mRNA检测，将有助于胸腔积液的病因诊断。

　　本组有5 例恶性胸腔积液标本中未见hTERT mRNA表达。出现“假阴性”的可能原因有：①胸腔积液中脱落的肿瘤细胞数可能过少。②在人类常见的各种肿瘤中大约有10%～20%的肿瘤细胞不表达端粒酶活性， 故恶性胸腔积液脱落细胞中的 hTERT mRNA也难以达到100%。16 例良性胸腔积液标本中， 有3例 hTERT mRNA表达阳性， 都是来自结核性胸膜炎患者，这可能与淋巴细胞可低水平表达端粒酶活性表达有关［10］。

参考文献

［1］ Motherby H， Nadjari B， Remmerbach T， et a1.Static DNA cytometryas a diagnostic aid in effusion cytology: Ⅱ.DNA aneuploidy for identification of neoplastic cells in equivocal effusions［J］. Anal Quant Cytol Histol， 1998， 20(3): 162-l68.

［2］ Ulaner GA， Giudice LC， Hoffman AR， et al.Telomerase activity in human development is regulated by human telomerase reverse transcriptase(hTERT) transcription and by alternate splicing of hTERT transcripts［J］.Cancer Res， 1998， 58(18):4168.

［3］ Dhaene K， Van Marck E， Parwaresch R.Telomeres， telomerase and cancer: an update［J］. Virchows Arch， 2000，437(1):1.

［4］ Humphreys MJ， Ghaneh P， Greenhalf W， et al.Hepatic intraarterial delivery of a retroviral vector expressing the cytosine deaminase gene，controlled by the CEA promoter and intraperitoneal treatment with 5fluorocytosine suppresses growth of colorectal liver metastases［J］.Gene Ther，2001，8 (16):1241-1247.

［5］ Shibuya K， Fujiaswa T， Hoshino H，et al.Increased telomerase activity and elevated hTERT mRNA expression during multistage carcinogenesis of squamous cell carcinoma of the lung［J］.Cancer，2001，92(4) :849-855.

［6］ Njiyama H， Mizumoto K， Sato N，et al.Quantitative analysis of hTERT mRNA expression in coierectal cancer［J］.Am J Gastronenterol 2001，96(6) :1885-1900　

［7］ Nagao K， Tomimntsu M， Endo H，et al.Telomerase reverse manscriptase mRNA expression and telomerase activity in hepatocellalar carcinoma［J］.J Gastroenterol，1999，34(1) :83-87.

［8］ Cong YS， Wright WE， Shay JW，et al.Human telomerase and its regulation［J］.Microbiol Mol Biol Rev，2002，66 (3) :407-425.

［9］ Kolquist KA， Ellisen LW， Couter CM， et al.Expression of hTERT in early malignant lesions and a subset of cells in normal tissues［J］.Nat Gnent，1998， 18(2):182-186.

［10］ Fujita Y， Fujikane T， Fujiuchi S， et al.The diagnostic and prognostic relevance of human telomerase reverse transcriptase mRNA expression detected in situ in patients with nonsmall cell lung carcinoma［J］.Cancer， 2003， 98(5): 1008-1013.