Livin基因在非小细胞肺癌中表达的分子生物学特性

【关键词】 Livin基因; 非小细胞肺癌; 分子生物学

　　原癌基因和抑癌基因所编码的蛋白存在于细胞的各个组成部分中，包括细胞核、细胞质、线粒体和细胞膜。通过对原癌和抑癌基因蛋白结构和功能的分析，发现许多原癌基因和抑癌基因位于信号通路中的不同部位，参与许多重要的细胞活动过程，如细胞生长和分化、DNA复制和损伤修复、基因转录和表达、细胞周期调控等，在细胞凋亡、衰老过程中起重要作用，也在肿瘤的发生发展和转移中扮演重要角色。Livin蛋白是新近发现的凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族的新成员之一，具有抗细胞凋亡作用，并明显地在肿瘤组织中特异性表达。目前的研究表明， Livin基因在各系统的正常组织中很少表达，但在胚胎组织或发育组织、淋巴细胞性白血病、胃癌、膀胱癌、乳腺癌和黑色素瘤等多种组织中广泛表达。非小细胞肺癌（nonsmallcell lung cancer，NSCLC）的肿瘤细胞系中也有Livin基因的表达，但其与肿瘤的发生、转移、耐药性等之间的确切关系尚不清楚。Livin基因特异性地表达于肿瘤组织，有可能成为NSCLC早期诊断的分子标志物，并为基因治疗提供新靶点［1-3］。本文就Livin基因在NSCLC中的表达及其抗细胞凋亡作用、信号传导途径与调节机制等分子生物学特性作一综述。
　　
　　1 Livin基因及蛋白结构功能的多样性
　　
　　IAP是一类重要的抗细胞凋亡因子，其共同的结构特征是N端含有一个或多个(最多为3个)串联的杆状病毒IAP重复序列结构域(baculovirus IAP repeats domain，BIRs)和C端含有一个环指结构域(RING finger domain，RING)。目前已发现人类IAP家族有8个成员，即NIAP，XIAP(ILP1/MIHA)，cIAP1(HIAP2/MIHB)，cIAP2(HIAP1/MIHC)，survivin(TIAP)，apollon(Bruce)，ILP2(TsIAP) 和livin(MLIAP/KIAP)［2］。
　　
　　Livin蛋白是IAP家族的一个新成员，一些实验室采用IAP同源序列(BIR或RING)寻找的方法，分别从人类基因组cDNA文库中克隆得到Livin核苷酸序列，从不同的组织中发现了Livin基因的表达。Kasof等［3］在发育组织和肿瘤组织中发现并命名了Livin基因。Lin等［4］从人胎肾cDNA文库中分离到该基因，故称其为KIAP（kidney inhibitor of apoptosis protein，KIAP）。Vucic等［5］发现Livin基因在G361 和 SKMel29两种黑色素瘤细胞源株中高表达，将其命名为MLIAP（melanoma inhibitor of apoptosis protein）。Ashhab等［6］发现了该基因存在2个剪接变异体（isoforms），分别命名为Livin α和Livin β。 同时，Lin等［4］用荧光原位杂交方法确定Livin基因位于人20号染色体20q13.3区域，全长4.6 kb，包含7个外显子。此外还发现存在长约2.2，2.8和4.0 kb的转录子，Livin蛋白N端仅包含一个BIR结构，包含4个α螺旋和一个三股抗平行 β片层，与相应的氨基酸残基共同构成疏水核心。C端含有一个RING环指结构［4，6］，氨基酸残基C124，C127，H44及C151与锌原子结合，借以稳定整个重叠结构。
　　
　　Livin蛋白有α和β两种变异体，分别由298和280个氨基酸组成，二者相差18个氨基酸，此区域由介于BIR和RING结构之间的第6外显子5′端54 bp的基因序列编码。Livin蛋白主要表达于胞质，但Kasof等［3］认为livin蛋白的细胞内分布与Survivin蛋白相似，Livin蛋白既在胞质内呈丝状表达，同时也表达于胞核，并认为livin蛋白 C末端的RING结构对介导其在亚细胞水平上的分布具有重要作用。Livin基因mRNA 3′端非翻译区多腺苷酸化与存在未剪接加工成熟的前体RNA有关，不同的剪辑有不同的变异体及亚型，这种结构基础有可能解释Livin基因蛋白存在多个结构功能。如BIR结构域内单个氨基酸的突变就能发挥其抗凋亡作用，作者的实验也发现在A549细胞中表达的Livin 蛋白缺少66个核苷酸的变异体，其确切的功能意义尚不清楚。但Livin基因蛋白结构的变化与其功能的多样性存在明显的相关性。
　　
　　2 Livin基因在NSCLC中的表达
　　
　　Livin基因仅在少数正常组织中表达，各家报道的研究结果存在较大差异，目前还不能确定Livin基因在人正常组织中的表达谱及其生理意义［2，7］。Tanabe等［7］采用 RTPCR法对15例正常肺组织和38例NSCLC组织作对比研究，发现Livin mRNA在NSCLC组织阳性率为73.6%，正常肺组织阳性率为6.7%，显示Livin基因在NSCLC中呈高表达，同时证明Livin基因与Survivin基因在NSCLC中的表达并不相关。CrnkovicMertens 等［1，8］同时采用NSCLC组织和NSCLC源 HeLa细胞株培养检测Livin基因及其两种异构体Livin α和Livin β的表达，结果显示Livin α和Livin β在NSCLC中呈高表达。采用RNAi技术分别使异构体基因沉默，发现Livin β和Livin α基因的功能意义不完全相同， Livin β在细胞凋亡中起关键作用。国内崔肃等［9］采用RTPCR法检测NSCLC组织中Livin α mRNA和Livin β mRNA的表达，并用Western blot方法分析Livin蛋白的表达，结果显示45例NSCLC组织中Livin mRNA表达阳性率为71.1％，两种异构体基本同时表达，Livin β mRNA的表达量略高于Livin α mRNA。而在癌旁正常肺组织和肺良性瘤样病变组织呈低表达，阳性率分别为5.7％和6.7％。而且Livin mRNA表达阳性标本中均能检测到Livin蛋白表达。陈淼等［10］采用免疫组织化学(SABC)的方法检测Livin蛋白在40例NSCLC组织以及12例正常和肺良性疾病组织中的表达，结果显示22例腺癌和18例鳞癌组织中的Livin蛋白阳性率分别为45.5﹪和50.0﹪，而正常肺组织和肺良性疾病组织均未检出Livin蛋白表达。他们同时观察到不同分化程度NSCLC组织之间Livin蛋白的表达无显著性差异。有和无淋巴结转移的肺癌组织中Livin蛋白表达的阳性率分别为72.7﹪和11.1﹪，两组的显著性差异标志着不同的生物学特性。孙建国等［11］ 的研究结果显示，48例NSCLC组织中Livin mRNA表达阳性率为22.9%，其表达与NSCLC组织学类型相关，腺癌中Livin mRNA表达阳性率达45.5%，明显高于鳞癌和大细胞癌，而癌旁组织和肺良性疾病组织均未检出阳性结果，而且Livin 蛋白表达与mRNA表达相一致。研究还发现放、化疗后NSCLC组织中的Livin表达的阳性率为43.5%，显著高于未放、化疗组织，提示放、化疗可明显诱导Livin蛋白的表达，这可能与临床上NSCLC对化疗药物和放疗耐受有关。
　　
　　目前，Livin基因在NSCLC组织中特异性地高表达的现象已引起许多学者的关注［1２］，但Livin mRNA的表达与NSCLC患者的病理分型、肿瘤分化程度、淋巴结转移及TNM分期等的相关关系尚未完全阐明，Livin基因作为NSCLC的分子标志物，成为诊断和治疗NSCLC新靶点的可能性已引起人们的极大兴趣。
　　
　　3 Livin抗细胞凋亡作用及其调节机制
　　
　　Kasof等［3，8］研究显示，Livin蛋白N端的羧基与Caspase3，7，9的直接结合，阻断了caspase发挥凋亡作用的途径，从而抑制了细胞凋亡的发生。将Livin基因转染HeLa细胞，受转染细胞内由FADD（Fasassociated protein with death domain），Bax，RIP，RIP3及DR6诱导的细胞凋亡可被有效阻断。Vucic等［13］将Livin基因转染乳腺癌MCF7细胞，证实转染细胞对Fas，TNFR1（tumor necrosis factor receptor 1），DR4（death receptor 4）及DR5介导的细胞凋亡具有显著的抑制作用。许多化疗药物可导致肿瘤细胞DNA的损伤而诱导细胞凋亡，转染Livin基因的MCF7细胞可有效对抗阿霉素以及4TBP（4 tertiary butylphenol）诱导的细胞凋亡。但是各家报道Livin α和Livin β蛋白的抗细胞凋亡作用存在一定差异。Yang等［14，15］观察在Jurkat T淋巴细胞株中，Livin基因可明显抑制由TNFα及抗CD95抗体诱导的细胞凋亡，其抗细胞凋亡作用强于Bcl 2。Livin α对STS诱导的Jurkat细胞凋亡表现出一定的抑制作用，而Livin β则无此作用。CrnkovicMertens 等［8］ 采用RNA干扰技术分别使内源性Livin α和Livin β基因沉默，检测两者的抗凋亡作用，结果显示Livin β可显著抑制依托泊苷（etoposide）和紫外线放射治疗（UV irradiation）等诱导的HeLa细胞凋亡，但Livin α则不明显。更多的研究则认为Livin α和Livin β基因均具有抗细胞凋亡作用，二者可能具有不同的激活途径有待进一步证实。
　　
　　许多研究证实［12-16］，Livin蛋白介导细胞凋亡抑制存在不同的调节途径，通过与激活形式的Caspase 3和Caspase 7结合，抑制其活性。Livin蛋白还可与未加工的或断裂形式的Caspase 9结合，可抑制由Apaf 1（apoptosis protein activating factor 1）、细胞色素C及dATP诱导的Caspase 9激活作用。 Livin蛋白与Caspase的结合抑制作用具有高度的特异性和亲和性，BIR结构域内单个氨基酸的突变即可导致Livin蛋白与Caspase的结合作用的减弱或消失，致使Livin蛋白抗细胞凋亡作用的明显降低甚至完全丧失，这也许可成为基因治疗的调节点。Sanna 等［12］的研究显示，Livin可激活MAP（mitogen activated protein）激酶JNK1和JNK2，但对JNK3无激活作用，而Livin蛋白对JNK1的激活作用远远强于JNK2，并且这是Livin蛋白对抗TNFα和ICE介导的细胞凋亡作用的重要途径之一。 JNK蛋白家族可直接由MKK4/MKK7激活，但Livin蛋白对JNK1的激活并不依赖于MKK4/MKK7信号途径，而是通过TAB1/TAK1途径实现。 TAK1是MAP3激酶之一，在TGFβ1的刺激下TAK1可激活JNK1。 TAB1是TAK1的共活化因子（coactivator），TAB1本身对于JNK1无激活作用，但可促进TAK1介导的JNK1激活作用。Livin蛋白可与TAB1结合，并进一步激活TAK1。此外，Vucic 等［13］证实SMAC（ second mitochondrial activator of caspases， SMAC）及活性肽片段可与Livin蛋白的BIR结构域特异性结合，抑制Livin蛋白与caspase的结合及其抗细胞凋亡作用。因此存在着由SMAC介导的对Livin蛋白抗细胞凋亡作用的负性调节机制。
　　
　　4 Livin基因治疗NSCLC的临床应用前景
　　
　　鉴于Livin基因具有明显的抗细胞凋亡作用以及在肿瘤组织中的特异性表达，人们注意到其与肿瘤发生发展的关系，并开始探讨Livin用于肿瘤基因治疗的可行性。应用基因转染技术可获得稳定表达Livin α和Livin β的NSCLC A549细胞克隆。孙建国等［17］用平板克隆形成实验研究A549细胞生长情况，用MTT法检测其对放、化疗的敏感性，用细胞周期分析法观察细胞凋亡情况。结果发现转染Livin α和Livin β基因后的细胞尤其是表达Livin α的A549细胞，克隆形成能力提高、倍增时间缩短，对多种化疗药物和放射线敏感性降低，10 Gy放射线照射下仅有0.2%细胞发生凋亡。可见 Livin基因参与NSCLC的发生发展，也可能是NSCLC细胞对放、化疗耐受的重要机制之一。
　　
　　CrnkovicMertens等［18］利用基因转染和特异性小干扰RNA(siRNA)技术，在肺癌SPCA1细胞株中建立Livin异构体α和β特异的基因沉默体系，观察诱导SPCA1细胞凋亡效应中的不同作用，并用TUNEL法和流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果显示内源性Livin α和Livin β基因沉默后，SPCA1细胞克隆形成能力较对照组显著下降，促使SPCA1细胞发生凋亡，表明Livin α和Livin β两种异构体均能作为诱导肺癌细胞凋亡的分子靶点，通过使Livin基因沉默的靶向诱导肺癌细胞凋亡可作为手术、化疗、放疗等传统治疗的辅助手段。
　　
　　由于Livin基因仅在肿瘤组织表达而在正常组织极少表达，Yagihashi等［19］用ELISA法在肺癌患者外周血和肿瘤组织中均检测到自身Livin蛋白抗体，其组织特异性显而易见。Hariu等［20］ 用Livin反义核苷酸片段刺激周围淋巴细胞，发现HLAA24与Livin 7肽具有特殊亲和力，Livin蛋白表达阳性的NSCLC患者可检测到特异性细胞毒T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTLs），而Livin蛋白表达阴性NSCLC患者则测不到CTLs。结果提示Livin蛋白可成为NSCLC免疫治疗的靶点，将Livin 7肽作为免疫制剂具有良好的应用前景。

　　综上所述，Livin基因是肿瘤细胞凋亡途径中的一个信号调节点，其在NSCLC组织中的特异性表达为NSCLC的诊断提供了新的分子标记物，亦可成为NSCLC治疗的新靶点［21，22］。目前，人们已能在基因水平上干预因基因表达异常而导致的疾病，尤其是以mRNA为靶标的反义药物，可抑制和消除致病基因的表达，达到治疗的目点。因此，采用反义核苷酸（antisense oligonucleotides）、小分子抑制剂（smallmolecule inhibitors）和免疫介入（immunemediated approaches）等基因治疗手段直接阻断Livin 蛋白与目的分子的结合，可以促使肿瘤细胞的凋亡，为NSCLC的治疗开辟新的途径［23，24］。同时，对NSCLC患者肿瘤组织和外周血免疫细胞的Livin蛋白（受体）及其mRNA表达的联合检测，有可能成为NSCLC早期诊断、转移风险和预后的分子标记物。

参考文献

　　［1］ CrnkovicMertens I， Muley T， Merster M， et al. The antiapoptotic livin gene is an important determinant for the apoptotic resistance of nonsmall cell lung cancer cells［J］. Lung Cancer， 2006，54(2):135-142

　　［2］ Salvesen GS， Duckett CS. IAP proteins: Blocking the road to death′s door［J］. Nat Rev Mol Cell Biol， 2002，3(6): 401-410.

　　［3］ Kasof GM， Gomes BC. Livin， a novel inhibitor of apoptosis protein family member［J］. J Biol Chem， 2001， 276(5): 3238-3246.

　　［4］ Lin JH， Deng G， Huang Q， et al. KIAP， a novel member of the inhibitor of apoptosis protein family［J］. Biochem Biophys Res Commu， 2000，279(3): 820-831.

　　［5］ Vucic D， Stennicke HR， Pisabarro MT， et al. MLIAP， a novel inhibitor of apoptosis that is preferentially expressed in human melanomas［J］. Curr Biol， 2000，10(21): 1359-1366.

　　［6］ Ashhab Y， Alian A， Polliack A， et al. Two splicing variants of a new inhibitor of apoptosis gene with different biological properties and tissue distribution pattern［J］. FEBS Lett， 2001，495(12): 56-60.

　　［7］ Tanabe H， Yagihash A， Tsuji N， et al. Expression of survivin mRNA and livin mRNA in nonsmallcell lung cancer［J］. Lung Cancer， 2004，46(3):299-304.

　　［8］ CrnkovicMertens I， Semzow J， HoppeSeyler F， et al. Isoformspecific seilencing of the Livin by RNA interference defines Livin beta as key mediator of apoptosis inhibition in HeLa cells［J］. J Mol Med， 2006，84(3):232-240.

　　［9］ 崔 肃，陈东义， 韩力波，等.凋亡抑制蛋白Livin在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义［J］.中国肿瘤临床，2006，33（5）：249-252.

　　［10］ 陈 淼，陶晓南，张晓菊.凋亡抑制蛋白Livin在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义［J］.广东医学，2006，27（7）：1014-1015.

　　［11］ 孙建国，廖荣霞，陈正堂，等.一种新的凋亡抑制蛋白Livin在非小细胞肺癌组织中的表达［J］.重庆医学，2004，33(7):982-984.

　　［12］ Sanna MG， da Silva Correia J， Ducrey O， et al. IAP suppression of apoptosis involves distinct mechanisms: The TAK1/JNK1 signaling cascade and caspase inhibition［J］. Mol Cell Biol， 2002，22(6):1754-1766.

　　［13］ Vucic D， Deshayes K， Ackerly H， et al. SMAC negatively regulates the antiapoptotic activity of melanoma inhibitor of apoptosis(MLIAP)［J］. J Biol Chem， 2002，277(14): 12275-12279.

　　［14］ Yang F， Sarangarajan R， Le Poole IC， et al. The cytotoxicity and apoptosis induced by 4tertiary butylphenol in human melanocytes are independent of tyrosinase activity［J］.J Invest Dermatol， 2000，114(1): 157 -164.

　　［15］ Andersen MH， Reker S， Becker JC， et al. The melanoma inhibitor of apoptosis protein:a target for spontaneous cytotoxic T cell responses［J］. J Invest Dermatol， 2004，122(2):392-399.

　　［16］ Yan H，Brouha B， Liu T， et al. Proteolytic cleavage of Livin(MLIAP) in apoptotic melanoma cells potentially mediated by a noncanonical caspase［J］. J Dermatol Sci， 2006，43(3):189-200.

　　［17］ 孙建国，廖荣霞，陈正堂，等.Livin异构体基因转染对肺腺癌A549细胞生长及放化疗敏感性的影响［J］. 中华结核和呼吸杂志，2005，28（12）：836-840.

　　［18］ CrnkovicMertens I， HoppeSeyler F， Butz K. Induction of apoptosis in tumor cells by siRNAmediated silencing of the Livin/M LIAP/KIAP gene［J］. Oncogene， 2003，22(51): 8330-8336.

　　［19］ Yagihashi A， Asanuma K， Kobayashi D， et al. Detection of autoantibodies to livin and survivin in sera from lung cancer patients［J］. Lung Cancer， 2005，48(2):217-221.

　　［20］ Hariu H， Hirohashi Y， Torigoe T， et al. Aberrant expression and potency as a cancer immunotherapy target of inhibitor of apoptosis protein family，Livin/MLIAP in lung cancer［J］. Clin Cancer Res， 2005，11(3):1000-1009.

　　［21］ Schmollinger JC， Vonderheide RH， Hoar KM， et al. Melanoma inhibitor of apoptosis protein(MLIAP) is a target for immune mediated tumor destruction［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2003，100(6): 3398-3403.

　　［22］ Hassan MA， Braam SR， Kruyt FA. Paclitaxel and vincristine potentiate adenoviral oncolysis that is associated with cycle and apoptosis modulation， whereas they differentlly affect the viral life cycle in nonsmallcell lung cancer cells［J］.Cancer Gene Ther， 2006，13(12):1105-1114.

　　［23］ Kumar A，Wakelee H. Secondthirdline treaments in nonsmall cell lung cancer［J］. Curr Treat Options Oncol， 2006，7(1):37-49.

　　［24］ Chang H，Schimmer AD. Livin/melanoma inhibitor of apoptosis protein as a potential therapentic target for the treatment of malignancy［J］. Mol Cancer Ther， 2007，6(1):24-30.