氧化苦参碱对青霉素致痫大鼠海马GABA、Glu及血清中细胞因子的影响

　　　　　　 作者：胡淑婷，张志宁，陈晓霞，白洁

【摘要】 　　目的 研究氧化苦参碱(Oxymatrine，Oxy)对青霉素致痫大鼠海马内谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)和血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-2(IL-2)和白细胞介素-6(IL-6)含量的影响，探讨其抗癫痫的可能机制。方法 以青霉素诱导SD大鼠癫痫模型，采用放射免疫测定法检测血清中TNF-α、IL-2和IL-6的含量，免疫组化SABC法测定海马谷氨酸(Glu)和γ-氨基丁酸(GABA)阳性神经元的含量。结果 Oxy组与青霉素模型组比较：血清中TNF-α、IL-2和IL-6的含量明显降低(P＜0.05)，海马内GABA阳性细胞数明显增加，Glu阳性细胞数明显减少(P＜0.01)。结论 Oxy拮抗癫痫发作，机制可能与调节癫痫大鼠脑内的GABA与Glu的水平，降低TNF-α、IL-2和IL-6有关。

【关键词】 氧化苦参碱；癫痫；谷氨酸；γ-氨基丁酸；肿瘤坏死因子-α；白细胞介素-2；白细胞介素-6

　　Abstract: Objective To explore the effect of oxymatrine (Oxy) on the content of glutamate（Glu）， γ amino butyric acid（GABA） in hippocampus and tumor necrotic factorsα（TNFα），interleukin2（IL2）， interleukin6（IL6）in serum of epileptic rats kindled by penicillin. Methods　　Penicillin kindled epileptic rat model was used. The level of TNFα，IL2， IL6 in serum. Glu were determined by radioimmunoassay and GABA immunoreactive positive cells were identified by SABC of immunohistochemical method. Results Level of TNFα、IL2 and IL6 in serum in the Oxy group were significantly lower (P＜0.05) than those in penicillin model group. GABA immunoreactive positive cells in the hippocamps were significantly increased.Glu immunoreactive positive cells in the hippocamps were significantly reduced（P＜0.01）in the Oxy group as compared with penicillin model group. Conclusion Oxy has the effect of antiepileptic activation. The mechanism of which may be related with the adjustment of the level of GABA， Glu and the level of cytokines and improvement of the imbalance of neuroimmunoendocrine network.

　　Key words: oxymatrine； epilepsy； glutamate； GABA；TNFα；IL2；IL66

　　氧化苦参碱(Oxymatrine，Oxy)是从豆科槐树植物苦豆子中分离提纯出来的一种生物碱，属于四环的喹嗪啶类。近年来已发现其在心血管系统、抗病毒、抗炎和抗肿瘤等方面有重要的药理作用［1］，而本室通过前面的实验研究发现并已证实Oxy具有抗癫痫作用。为进一步探讨Oxy可能的抗癫痫机制，本文拟通过青霉素致痫大鼠模型，采用放射免疫法和免疫组化法检测癫痫大鼠血清中THF-α、IL-2和IL-6以及脑组织海马区γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸(Glu)的含量变化，并观察Oxy对其的影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 动物

　　健康成年雄性Sprague-Dewey(SD)大鼠，体重200～250g，宁夏医学院实验动物中心提供，室温18～20℃，自由饮食。

　　1.2 试剂及仪器

　　氧化苦参碱(Oxy，宁夏紫荆花药业提供，批号为960304)；苯巴比妥钠(PBS，上海新亚药业有限公司生产，批号为050703)；青霉素(宁夏启元药业有限公司生产，批号为050428)；多聚甲醛(北京益利精细化学品有限公司生产，分析纯，批号为20020203)；兔抗GABA多克隆抗体、兔抗Glu多克隆抗体、SABC试剂盒、浓缩型DAB试剂盒、磷酸盐缓冲液(武汉博士德生物工程有限公司生产)；TNF-α、IL-2、IL-6放射免疫检测试剂盒(北京科美东雅生物技术开发有限公司生产)；多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine，Sigma公司生产)。冷冻切片机，Olympus CHC-212型光学显微镜(日本产)。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 实验动物分组及给药

　　健康成年雄性SD大鼠64只，随机分为4组：正常对照组、阳性苯巴比妥钠(PBS)对照组、模型组和Oxy组，每组16只大鼠，其中8只用于GABA、Glu的免疫组化，8只用于TNF-α、IL-2、IL-6的放射免疫测定。①正常对照组：腹腔注射与药物等溶剂的生理盐水；②阳性对照组：腹腔注射PBS 10mg/kg；③模型组：腹腔注射青霉素800万U/kg；④Oxy组：腹腔注射Oxy147.45mg/kg(ED50)。

　　1.3.2 模型的制作及大鼠惊厥分级

　　除正常对照组外，其它各组大鼠腹腔注射青霉素800万U/kg，观察大鼠痫性发作的表现。按照Racine分级法［2］，将动物痫性发作的表现分为：0级：无惊厥；I级：湿狗样颤动，面肌抽动、咀嚼；II级：面部阵挛伴节律性点头；III级：面部阵挛、律性点头、前肢阵挛；IV级：前肢阵挛、后肢站立；V级：失去平衡、跌倒、四肢抽动、全身阵挛。凡显示IV级以上发作的惊厥大鼠为达到点燃标准。正常对照组给予相同剂量生理盐水。

　　1.3.3 TNF-a、IL-2和IL-6的测定

　　采用预防性给药，正常对照组、阳性PBS对照组和Oxy组大鼠分别腹腔注射生理盐水、PBS、Oxy，模型组大鼠腹腔内注射相同容量的蒸馏水。给药1h后，腹腔注射青霉素800万U/kg致痫。待动物痫性发作1h，腹腔注射10mg/kg乌拉坦麻醉，暴露颈静脉，抽血2mL离心沉淀，-20℃保存。测定前置室温复融，混匀，4℃ 3000r/min 离心5min，取上清液采用放射免疫分析法测定各组大鼠血清中TNF-α、IL-2和IL-6含量。

　　1.3.4 脑组织海马区Glu和GABA阳性神经元测定

　　1)灌注和取材 待动物痫性发作1h后，迅速开胸暴露心脏，经左心室插管至升主动脉，先用冷生理盐水100mL快速灌注，继之灌入500mL含4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定，持续1h。取大鼠全脑后固定于上述灌注液内2h，再置于20%蔗糖中12h，经磷酸盐缓冲液洗涤后取含海马结构的部位做冠状切片，片厚约20μm，室温下风干，于-20℃冰箱内保存备用。每只大鼠取海马切片4张，2个用于GABA检测，2个用于Glu检测。

　　2)GABA和Glu的免疫组化染色 按常规SABC法进行免疫组化检测，DAB染色，以磷酸盐缓冲液取代一抗和二抗作空白对照，应用Image-proplus 图像分析仪进行显微摄像。在光学显微镜下对海马CA1区GABA、Glu免疫组化阳性细胞进行计数分析。

　　1.4 统计学方法

　　所有实验数据均用均数±标准差(±s)表示，采用SPSS 11.0统计软件进行方差分析和t检验。

　　2 结果

　　2.1 Oxy对血清TNF-α、IL-2和IL-6的影响(表1)表1 Oxy对大鼠血清中细胞因子含量的影响(略)

　　PBS和Oxy组与模型组比较，TNF-α、IL-2和IL-6的含量降低(P均＜0.05)。模型组与正常对照组比较，TNF-α、IL-2和IL-6的含量明显升高(P均＜0.01)。PBS、Oxy组与正常对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

　　2.2 Oxy对海马GABA 和Glu免疫阳性细胞的影响

　　光镜下可见正常对照组大鼠海马GABA免疫反应阳性细胞，细胞胞浆呈棕褐色，胞体呈圆形、卵圆形、三角形等多种形态(图1，见封2)；模型组大鼠海马GABA免疫反应阳性细胞较少(图2，见封2)。PBS(图3，见封2)和Oxy组大鼠海马GABA免疫反应阳性细胞明显增多(图4，见封2)。正常对照组大鼠海马Glu免疫反应阳性细胞胞浆呈棕褐色，阳性细胞数量相对较少(图5，见封2)。模型组大鼠海马Glu免疫反应阳性细胞数量明显增加(图6，见封2)。PBS(图7，见封2)和Oxy组大鼠海马Glu免疫反应阳性细胞明显减少(图8，见封2)。
　　
　　PBS和Oxy组与模型组比较，大鼠海马CA1区GABA免疫反应阳性细胞数增加，Glu免疫反应阳性细胞数减少(P＜0.01)，见表2。表2 各组大鼠海马CA1区Glu和GABA免疫组织化学反应阳性细胞数(略)

　　3 讨论

　　青霉素是经典的致痫剂［3］，能抑制GABA能神经元，引起抑制性突触活动减弱或兴奋性突触活动增强，从而导致神经元兴奋性增高，出现异常放电，而Oxy可明显抑制青霉素致痫大鼠皮层癫痫样放电，使潜伏期明显延长，具有一定的抗癫痫作用［4］。

　　研究表明，癫痫的发作与中枢神经系统兴奋性氨基酸类与抑制性氨基酸类神经递质的平衡失调密切相关［5］。GABA是中枢神经系统中最主要的抑制性神经递质，通过抑制作用维持着神经元兴奋与抑制的平衡，当该平衡被打破，则癫痫发作随之发生［6］。Glu是中枢神经系统的一种兴奋性神经递质，Glu的N-甲基-D-天(门)冬氨酸(NMDA)受体有调节对兴奋性突触传递起重要作用的N型钙离子通道的作用，点燃NMDA受体结合位点时兴奋性氨基酸突触传递及释放均有较持久的增加［7］。其含量的增高及释放的增加导致兴奋性、神经毒性作用增强。从本研究表2可以得出，Oxy组GABA平均阳性细胞数高于模型组，Glu平均阳性细胞数低于模型组，Oxy组与PBS阳性对照组比较差异无统计学意义，说明Oxy在中枢神经系统中不仅影响抑制性神经递质GABA的合成和释放，同时也可干预兴奋性神经递质Glu的释放，维持兴奋性与抑制性氨基酸之间的平衡关系，减少因外来因素造成二者的失衡，从而抑制癫痫的发生。推测其可能的抗癫痫机制是对GABA神经元起保护修复作用，提高GABA神经元内GABA递质的合成及向细胞外释放，或同时减少GABA的重摄取和降解，提高整体脑组织内的GABA含量，通过抑制性突触后电位降低兴奋性。同时也降低了Glu等兴奋性神经递质在脑内的整体含量，减少了它们对神经组织的兴奋毒性作用，从而在双方面共同抑制癫痫的异常放电，起到抗癫痫作用。

　　细胞因子是一种由免疫活性细胞产生的α分子多肽或蛋白，具有维持和调控机体造血和免疫系统的生理功能。白细胞介素作为一种重要的细胞因子，在一些神经系统疾病，如癫痫、缺血性脑损伤，阿尔茨海默病及多发性硬化等退行性疾病中，有不同程度的升高［8］。其中IL-2不仅参与机体的免疫应答反应，而且还参与中枢神经系统部分生理或病理过程，其通过升高神经元细胞内游离钙浓度，增加N-甲基-D-天门冬氨酸受体1型亚单位(NMDAR1)mRNA量的表达，以促进NMDAR1合成，从而发挥兴奋性神经调质样作用［9］。TNF-α是由巨噬细胞和淋巴细胞分泌，它可以作为一种神经调质，在癫痫发病过程中起着促进作用［10］，主要是影响癫痫发作过程中兴奋性氨基酸(如Glu)和抑制性氨基酸(如GABA)的平衡，使得兴奋性氨基酸的含量增加，减弱抑制性突触后电位活动，最终导致癫痫放电［11］。IL-6主要由单核-巨噬细胞、T淋巴细胞及纤维母细胞合成，其过量表达可促进海马星形胶质细胞增生，引起海马区脑电图癫痫样改变，参与癫痫的发生［12］。本研究表1结果显示，Oxy组与模型组比较，TNF-α、IL-2和IL-6的含量显著降低，说明Oxy的抗癫痫作用机制与免疫系统有关。此外，PBS阳性对照组、Oxy组与正常对照组比较以及Oxy组与阳性对照PBS组比较，癫痫大鼠血清中TNF-α、IL-2和IL-6的含量差异均无统计学意义，这些对今后Oxy药物的研究与开发具有一定的参考价值。
　　
　　总之，该实验结果显示Oxy对癫痫的发作有拮抗作用，可能与调节癫痫大鼠脑内的GABA与Glu的水平、细胞因子的含量，从而改善神经-免疫-内分泌网络的失衡有关。至于通过何种途径影响，分子机制又如何，还有待于今后进一步研究。

参考文献

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