作者：张娟，张鸣号， 李慧，徐华， 王秀梅，李桂忠，曹军
【摘要】 目的 探寻β-甘油磷酸盐诱导原代培养人脐静脉平滑肌细胞(HUSMC)钙化的适宜浓度。方法 采用原代培养人脐静脉平滑肌细胞，根据培养液中β-甘油磷酸盐浓度不同依次分为8组：正常对照组、10mM组、12mM组、14 mM组、16 mM组。以更换培养液当天记为第1天，培养10d，von kossa染色观察细胞钙沉积情况、显微图像分析法测量钙化阳性细胞百分比、比色法检测细胞内钙含量和碱性磷酸酶活性。结果 对照组SMC银染无钙结节，显微图像分析阳性细胞为(0.1060±0.05)%；12mM组SMC银染可见明显钙结节存在，钙化阳性细胞数为（4.7009±1.35)%，钙含量和碱性磷酸酶活性较对照组明显升高(P＜0.05)。10mM组、16mM组、20mM组、30mM组与对照组相比钙含量和碱性磷酸酶活性差异无统计学意义 (P＞0.05)，但10mM组、16mM组钙化阳性细胞百分比升高明显(P＜0.05)，20mM组、30mM组与对照组相比钙化阳性细胞百分比差异无统计学意义 (P＞0.05);40mM组钙含量和碱性磷酸酶活性明显降低(P＜0.001)，灰度扫描钙化阳性细胞随之降低。结论 12mM β-甘油磷酸盐可刺激人脐静脉平滑肌细胞出现钙盐沉积，且人脐静脉SMC钙化对β-甘油磷酸盐无浓度依赖性。
【关键词】 人脐静脉血管平滑肌细胞；β-甘油磷酸盐；血管钙化
Abstract: Objective To explore the the appropriate concentration of β-glycerol phosphate induced primary cultured human umbilical vein smooth muscle cells (HUSMC) calcification.Methods culturing Human umbilical vein smooth muscle cells in the presence of β-glycerophosphate(β-GP) were pided into eight different concentrations: normal control group(culture medium without β-GP)，10mM group(culture medium containing 10mM β-GP)，12mM group(culture medium containing 12mM β-GP)，14 mM group(culture medium containing 14mM β-GP)，16mM group(culture medium containing 16mM β-GP)，20 mM group(culture medium containing 20mM β-GP)，30 mM group(culture medium containing 30mM β-GP)，40 mM group(culture medium containing 40mM β-GP).The day in which the culture medium was replace was recorded as d1， and cultured for 10 days.Calcification was confirmed by von kossa staining，applied colorimetry detection of intracellular calcium content and alkaline phosphatase activity changes.Results In control group，there was non-calcium nodule with SMC silver staining; 12mM group of SMC silver staining could be seen the existence of calcium nodules clearly，calcium content and alkaline phosphatase activity in 12mM group was significantly higher than that in control group (P＜0.05).10mM group，16mM group，20mM group，30mM group and control group，calcium content and alkaline phosphatase activity showed no significant difference (P＞0.05); 40mM group calcium content and alkaline phosphatase activity showed significantly lower (P＜0.01).Conclusion Concentrations of 12mM β-glycerol phosphate may directly stimulate human umbilical vein smooth muscle cells to be calcified，and human umbilical vein SMC calcification showed no dose-dependent on β-glycerol phosphate.
Key words:HUSMC; β-glycerophosphate; vascular calcification
血管钙化是心血管疾病的重要危险因子之一，可导致血栓形成、血管僵硬度增加和动脉粥样硬化斑块破裂等严重后果。现已清楚血管钙化是一个主动的、可调控可预防的生物过程［1］，但其具体机制尚不清楚。临床研究发现高磷血症是血管钙化发生的独立危险因素［2-3］，高磷可上调平滑肌细胞中钠磷协同转运蛋白pit-1表达［4］、诱导成骨细胞核结合因子α亚单位-1(cbfα-1)表达增加［5］。目前体外实验多采用高磷即β-甘油磷酸盐诱导大鼠和牛血管平滑肌细胞钙化，但鼠和牛与人存在种属差别，因此采用人脐静脉平滑肌细胞(Human umbilical vein smooth muscle cell，HUVSMCs)进行钙化研究，相比较鼠及牛等实验动物能较真实的反应人类疾病发展规律。但β-甘油磷酸盐诱导人脐静脉平滑肌细胞钙化的适宜浓度尚未见报道，本实验采用不同浓度β-甘油磷酸盐干预脐静脉平滑肌细胞，探寻磷酸盐诱导脐静脉平滑肌细胞钙化发生的最佳浓度范围。
1 材料和方法
1.1 材料
人脐静脉取自宁夏医科大学附属医院妇产科足月男性新生儿脐带。β-甘油磷酸盐由上海如吉生物科技发展有限公司提供，碱性磷酸酶试剂盒、钙离子检测试剂盒由南京建成生物有限公司提供，DMEM/F12购自Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青，胰蛋白酶购自Sigma公司。余均为市售分析纯。
1.2 实验方法
1.2.1 原代血管平滑肌细胞培养
无菌条件下取足月新生儿脐带，于无菌D-hank’s液(含100U·mL-1青霉素和链霉素)中清洗脐带，挤出淤血，分离脐静脉，纵向剖开血管，切成5mm×5mm小块，用吸管将组织块吸起接种于培养瓶(100mL)中，翻转培养瓶，加入含20%胎牛血清的DMEM/F12培养液5mL，置于37℃5%CO2培养箱中，4h后翻瓶静置，进行培养，每3d换液1次，8d后可见少量细胞从组织块边缘爬出(图1A，见封4)，待细胞生长至80%融合进行传代。倒置相差显微镜下观察细胞呈梭形，典型的“峰谷状”生长(图1B，见封4)，α-actin鉴定平滑肌细胞阳性。
1.2.2 细胞传代
取2.5%胰酶1mL吸入培养瓶中，静置消化2～3min，倒置显微镜下观察见细胞间隙增宽，细胞边缘清晰即可终止消化，将培养瓶中胰酶倒掉，加入含10%胎牛血清、100U·mL-1青霉素和链霉素的DMEM/F12培养液中和胰酶，并轻轻吹打瓶壁，制备细胞悬液。细胞传至第3代开始，取生长旺盛的细胞接种进行实验。
1.2.3 平滑肌细胞计数及接种
细胞计数板计数，调整细胞数按105cells/well接种于6孔板培养，每3d换液1次，待生长至80%融合后分组进行实验。
1.2.4 钙化模型制备及分组
细胞在正常培养液中培养，待生长至80%融合后分为8组：对照组(含100U·mL-1青霉素和链霉素、3%胎牛血清的DMEM/F12培养液)和模型组(以正常培养液中加入β-甘油磷酸盐终浓度不同分为7个亚组：10mMβ-甘油磷酸盐组、12mMβ-甘油磷酸盐组、14mMβ-甘油磷酸盐组、16mMβ-甘油磷酸盐组、20mMβ-甘油磷酸盐组、30mMβ-甘油磷酸盐组、40mMβ-甘油磷酸盐组，依次简称为10mM组、12mM组、14mM组、16mM组)。每隔2d换液1次，连续培养10d，收集细胞做指标检测。
1.2.5 von kossa染色
制备细胞爬片，药物干预后，将单层细胞于4%多聚甲醛固定10min，蒸馏水冲洗2遍，于玻片上滴加5%硝酸银溶液，紫外灯下照射20min，至棕褐色絮状物出现，去掉硝酸银，蒸馏水轻轻冲洗3遍，2.5%硫代硫酸钠定影1min，蒸馏水轻轻洗细胞，立即观察平滑肌细胞钙沉积情况，封片，拍照。
1.2.6 显微图像分析系统检测细胞爬片钙化情况［6］
运用Motic Images Advanced3.2显微图像分析系统对von kossa染色图片进行分析。通过数码显微镜采集实时图像，选定整幅图像作为分割范围，统一分割范围及阈值，点击自动计算，对已分割好图像进行自动计算阳性细胞占总细胞数的百分比，记录数据。
1.2.7 碱性磷酸酶检测
用预冷的PBS冲洗细胞2次，每孔加入200μL细胞缓冲液，用刮刀轻轻刮取细胞，吸取细胞悬液于离心管中，置于冰中40W超声波破碎细胞5min，显微镜下证实细胞破碎完全后，于4℃ 3500r·min-1离心15min，取上清液分装，用AKP检测试剂盒在分光光度计上检测碱性磷酸酶活性。
1.2.8 钙含量检测
干预细胞10d后，六孔板内加入0.6N的盐酸脱钙24h，收集脱钙上清液，用钙测定试剂盒(甲基百里香酚蓝比色法)检测各组细胞钙含量。
1.3 统计学方法
结果用均数±标准差表示，多样本均数间比较采用One-wayANOVA检验，组间的两两比较采用Student-Newman-Keuls检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 平滑肌细胞钙化形态学分析
2.1.1 Von kossa染色观察
12 mM组与正常对照组比较，可见细胞聚集生长，在细胞聚集处有大量黑色结节存在；12mM组与10mM组相比较，细胞聚集成簇状生长较明显，可见黑色结节沉积，而10mM组未发现明显结节存在；14mM组、16mM组细胞聚集生长较少，钙化结节较12mM组相比明显减少;20mM组、30mM组平滑肌细胞生长聚集较少，呈密布生长，在细胞间隙可见少量黑色颗粒沉积；40mM组细胞生长较稀疏，细胞间偶有黑色颗粒存在(图2，见封4)。
2.1.2 不同浓度β-甘油磷酸盐干预平滑肌细胞von kossa染色显微图像分析
图像分析结果显示10mM组、12mM组、14mM组、16mM组与对照组相比阳性细胞百分比分别增高21.1倍、44.35倍、28.47倍、18.25倍(P＜0.05)，其中12mM组平滑肌细胞阳性细胞百分比增加最明显；12mM组与10mM组、14mM组、16mM组比较，阳性细胞百分比分别增加了110.42%、55.77%、143.03%，差异有统计学意义(P＜0.01)，20mM组、30mM组、40mM组与对照组差异无统计学意义 (P＞0.05)，见表1。
2.2 不同浓度β-甘油磷酸盐干预平滑肌细胞钙含量变化
结果显示，10mM组与对照组钙离子含量增加38.02%(P＜0.001)，12mM组钙含量与对照组相比钙含量增加46.43%(P＜0.001)，14mM组、16mM组与对照组相比亦分别增加了31.35%、37.55%(P＜0.001)；12mM组与10mM组相比钙含量增加6.10%，差异有统计学意义(P＜0.01)；14mM组、16mM组与10mM组比较均无统计学意义(P＞0.05)。14mM组、16mM组与12mM组比较钙含量分别减少了10.29%、6.06%(P＜0.01)。本实验以更高浓度β-甘油磷酸盐干预人脐静脉平滑肌细胞，结果发现随着β-甘油磷酸盐浓度增加，细胞钙化程度并未随着磷酸盐浓度增加而加重，20mM组、30mM组、40mM组与对照组相比，钙含量无明显变化，差异无统计学意义(P＞0.05)。且观察可见40mM组细胞干预过程中有细胞悬浮，推测40mM浓度的β-甘油磷酸盐可能会导致细胞大量死亡(表1)。
2.3 不同浓度β-甘油磷酸盐干预人脐静脉平滑肌细胞对碱性磷酸酶的影响
分别以不同浓度β-甘油磷酸盐干预平滑肌细胞，发现随着浓度增加平滑肌细胞内碱性磷酸酶活性出现先升高后降低呈抛物线趋势。与对照组相比10mM组碱性磷酸酶活性升高了10.76%，但差别无统计学意义(P＞0.05)。12mM组与对照组比较碱性磷酸酶活性升高22.92%，差异有统计学意义(P＜0.05)。与对照组相比，14mM组、16mM组、20mM组、30mM组、40mM组差异均无统计学意义(P＞0.05)。12mM组与14mM组、16mM组、20mM组、30mM组、40mM组比较碱性磷酸酶活性分别升高了6.32%、12.99%、12.5%、24.09%、25.99%，差别具有统计学意义(P＜0.05)。表明12mM浓度的β-甘油磷酸盐可使人脐静脉平滑肌细胞碱性磷酸酶活性增加(表1)。表1 不同浓度β-甘油磷酸盐干预后阳性细胞数、钙离子含量和碱性磷酸酶活性的变化（略）
3 讨论
现研究发现血管钙化是一种主动的可调控的生物过程［7－8］。多年研究证实高血糖、高血脂及高血磷可加速动脉粥样硬化的发展，是导致血管钙化的危险因素［9］。现已明确高磷可促使平滑肌细胞钙化，辅助羟磷灰石形成，触发潜在的平滑肌细胞转化机制［4］，因此多采用高磷复制体外血管钙化模型。目前大鼠及牛平滑肌细胞钙化模型的复制已较成熟，Sharon M等发现血管平滑肌细胞在高磷培养液中形成钙化结节，磷酸钠或β-甘油磷酸盐中的磷通过碱性磷酸酶与细胞膜结合，转入细胞内［11］。Atsushi Shioi等首次提出β-甘油磷酸盐作为高磷供体诱导平滑肌细胞钙化，其运用10mmol·L-1β-甘油磷酸盐可使牛主动脉平滑肌细胞发生钙化［12］，具体机制与碱性磷酸酶有关。之后的多项研究发现10mmol·L-1β-甘油磷酸盐干预平滑肌细胞，可使其发生成骨细胞表型改变［13］。Mei Y等培养大鼠平滑肌细胞，给予正常培养液或加入不同浓度胎牛血清(1%、3%或5%)，细胞均未发生自发性钙化。然而，在培养液中提高磷酸盐浓度，可诱导血管钙化发生［14］。
但目前实验多用大鼠等啮齿类动物或牛等哺乳动物作为取材对象复制平滑肌细胞钙化模型，大鼠和牛等动物与人类疾病发生发展过程存在明显的区别。容哲等对人与大鼠冠状动脉增龄变化的比较研究中发现大鼠和人类冠脉壁的组织结构及增龄变化有着明显差别，大鼠与人类动脉增龄变化及动脉硬化不同，二者间种属差异较显著，这种解剖学等差异提示用动物实验研究结果解释人类某些疾病机制时需慎重［10］。本实验采用人脐静脉平滑肌细胞作为研究对象，取材来源于人体细胞，消除了种属不同的差异，可以较准确的反应人类疾病发展规律。
现有报道用β-甘油磷酸盐亦可复制人脐静脉细胞钙化模型，预实验采用10mM β-甘油磷酸盐干预脐静脉平滑肌细胞，结果不能明显致细胞钙沉积形成。遂本实验设定8个不同浓度β-甘油磷酸盐进行干预，探索其致人平滑肌细胞钙化的最佳浓度范围。结果发现12mM β-甘油磷酸盐可促使大量细胞聚集生长形成结节样结构，钙化染色、钙含量及碱性磷酸酶活性等指标较对照组均明显升高(P＜0.05)。预实验时发现随着β-甘油磷酸盐浓度增加(10～40mM)，脐静脉平滑肌细胞钙化出现先升高后降低的抛物线趋势，随着浓度增加，14、16mM组平滑肌细胞钙化指标逐渐降低，而更高浓度20、30、40mM组β-甘油磷酸盐干预人脐静脉平滑肌细胞后，细胞钙化程度并未随着磷酸盐浓度的增加而加重，与对照组相比，钙含量无明显变化（P＞0.05），直到40mM组钙含量下降最明显，在药物干预期间也发现该浓度作用的细胞出现漂浮现象，推测有可能是药物浓度过高产生毒性作用所致。本实验结果说明由于存在种属差异，刺激人脐静脉平滑肌细胞钙沉积与牛、大鼠平滑肌细胞钙化所需的10mM β-甘油磷酸盐不同，12mM β-甘油磷酸盐才可明显刺激人脐静脉平滑肌细胞发生钙化，且不具有浓度依赖性，其具体机制有待于进一步研究。
此外，本实验首次采用显微图像分析法来定量判读von kossa染色。现对钙化von kossa染色的判定还停留在人眼观测的水平，这其中就不可避免的参杂了主观因素，使得判读结果不够准确。显微图像分析系统运用于免疫组化结果判读，可通过阳性细胞的平均灰度值和阳性细胞百分比等指标对观测对象进行定量测量。本实验运用显微图像分析系统较客观的计算出细胞钙化染色的阳性细胞百分比，对von kossa染色的结果进行定量分析，避免了主观因素对染色结果判定的误差。分析结果显示10mM、12mM、14mM、16mM β-甘油磷酸盐均可见平滑肌细胞发生钙沉积(P＜0.001)，但12mM组较其余干预组相比钙沉积明显加重。说明12mM β-甘油磷酸盐可最大量的刺激人脐静脉平滑肌细胞钙沉积，随着β-甘油磷酸盐浓度增加，细胞钙沉积出现先升高后降低的抛物线趋势，且无剂量依赖性。此测量结果与钙含量和ALP检测结果基本一致。
综上所述，复制平滑肌细胞钙化模型时，由于人与鼠、牛等动物的种属差异性，采用12mM β-甘油磷酸盐才可明显致人脐静脉平滑肌细胞钙沉积，且不具有浓度依赖性；其次，本实验首次采用显微图像分析法测量钙化染色阳性细胞百分比，可更准确的判读平滑肌细胞钙化程度，减少了主观因素造成的误差。
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