作者：高锋利，王淑静，李昭宇
【摘要】 目的 探讨RUNX3、p21CIP1/WAF1、cyclinD1蛋白在肝细胞性肝癌（HCC）和癌旁组织中的表达，以及三者在HCC组织中表达的相关性，三者的表达与临床病理因素之间的关系。方法 采用回顾性分析方法，收集43例HCC新鲜标本及其癌旁组织，用免疫印迹（Western Blot）技术检测癌及癌旁组织中RUNX3、p21CIP1/WAF1、cyclinD1蛋白的表达。结果 RUNX3、p21CIP1/WAF1蛋白在HCC组织中的相对表达值低于癌旁组织，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；cyclinD1蛋白在肝癌组织中的相对表达值高于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.001）；RUNX3、p21CIP1/WAF1、cyclinD1蛋白相对表达值均与TNM分期及组织分化程度有关（均P＜0.05）；HCC组织中RUNX3蛋白与p21CIP1/WAF1蛋白表达呈正相关（r=0.696，P＜0.05），RUNX3蛋白与cyclinD1蛋白表达呈负相关性（r=-0.435，P＜0.05）。结论 RUNX3蛋白可能通过影响p21CIP1/WAF1和cyclinD1蛋白的表达影响肝细胞性肝癌的发生发展;联合检测RUNX3、p21CIP1/WAF1和cyclinD1蛋白的表达可能对HCC的诊断及预后判断有一定参考价值。
【关键词】 肝细胞性肝癌;RUNX3;p21CIP1/WAF1;cyclinD1
Abstract: Objective To investigate the expression and clinical significance of RUNX3，p21CIP1/WAF1，cyclinD1 protein in human hepatocellular carcinoma（HCC）．Methods Western Blot was used to detect RUNX3，p21CIP1/WAF1，cyclinD1 protein expression level in samples of hepatocellular carcinoma and corresponding para-cancer tissue，which were obtained from surgically resection specimens of 43 patients.Results Western Blot showed that the expression of RUNX3 and p21CIP1/WAF1 in hepatocellular carcinoma was significantly lower than those in corresponding para-cancer tissue (P＜0.05) and the expression of cyclinD1 in hepatocellular carcinoma was significantly higher than that in corresponding para-cancer tissue(P＜0.05).The depression of RUNX3 was correlated with TNM stage and pathologic differentiation degree(P＜0.05).CyclinD1 and p21CIP1/WAF1expression was significantly associated with TNM stage and pathologic differentiation degree(P＜0.05).The correlationship between RUNX3 and p21CIP1/WAF1 expression was significant (r=0.696，P＜0.5) and there was a significant inverse correlationship between RUNX3 and cyclinD1 expression (r=-0.435，P＜0.05).Conclusion The abnormal expression of RUNX3，p21CIP1/WAF1，cyclinD1 gene in human hepatocellular carcinoma suggest that RUNX3，p21CIP1/WAF1，cyclinD1 gene may play an important roles in the development and progression of hepatocellular carcinoma.The combination detection of the three indices may provide reference to the diagnosis and evaluating the clinicopathological parameters of the hepatocellular carcinoma.
Key words:hepatocellular carcinoma; RUNX3; p21CIP1/WAF1; cyclinD1
肝癌的发生发展是多基因、多途径、多阶段共同作用的结果，与多种癌基因和抑癌基因变化有关。人类runt相关转录因子3(human runt-related transcription factor 3，RUNX3)被认为是一种新抑癌基因，可能在肝癌、胃癌等多种肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用［1-3］。目前RUNX3基因的表达调控及分子机制尚不完全清楚，研究表明其抑癌机制可能与TGF-β介导的细胞周期信号以及细胞凋亡途径相关［1，4］。在细胞周期的进程中，p21CIP1/WAF1-CDK-cyclinD1之间的相互作用是细胞周期调控的一种机制，p21CIP1/WAF1及cyclinD1作为细胞周期的正性和负性调节因子可能在RUNX3的抑癌机制中发挥作用。本研究运用蛋白免疫印迹（Western Blot）技术检测了RUNX3、p21CIP1/WAF1、cyclinD1蛋白在肝细胞性肝癌（HCC）中的表达情况，探讨在HCC中RUNX3表达的特点及与下游p21CIP1/WAF1、cyclinD1蛋白表达的关系，并分析RUNX3、p21CIP1/WAF1、cyclinD1蛋白表达与HCC临床病理特征的关系。
1 材料与方法
1.1 材料
收集宁夏医科大学附属医院2008年6月-2009年7月手术切除的43例肝细胞性肝癌及癌旁组织，癌组织均取自肿瘤中央非坏死部分，对应癌旁组织为距肿瘤2cm以上的肝组织，组织离体后在1h内置液氮中速冻，-80℃冻存备用。所有患者术前均未行任何抗癌治疗，临床资料完整，所有病例均经病理学证实。
1.2 试剂
细胞裂解液、蛋白分子量标准、DAB显色试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、鼠抗人β-actin单克隆一抗、鼠抗人p21CIP1/WAF1单克隆一抗和HRP标记的羊抗小鼠二抗均购自碧云天生物技术公司；鼠抗人RUNX3单克隆一抗、鼠抗人cyclinD1单克隆一抗购自Santa Cruz公司。
1.3 Western blot分析
称取100mg组织，按组织和细胞裂解液1∶10的比例加入全细胞裂解液，于冰上匀浆器充分匀浆后15000转4℃低温离心10min，取上清提取总蛋白，用酶标仪592 nm波长，行Binchoninic Acid(BCA法)蛋白定量。按每孔100μg蛋白上样，煮沸变性5min后，以12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，80V电压浓缩胶至分离胶后改为180V电压至分离胶底部，后经湿转法300mA 1.5h电转移至NC膜，5%脱脂奶粉室温封闭2h，NC膜置于一抗稀释液(1∶0稀释)中4℃过夜，PBST及PBS洗膜10min×4次，再置于二抗稀释液(1∶1000稀释)中室温孵育2h，PBST及PBS洗膜10min×4次，最后用DAB显色10～15min，至膜上出现棕色条带，显色适度时蒸馏水漂洗中止显色反应，拍摄滤膜照片。用Quantity One 4.31凝胶图象分析系统扫描灰度值，取各蛋白的灰度值与相应内参β-actin的比值代表各蛋白的相对表达水平，进行统计学分析。
1.4 统计学方法
采用SPSS 11.5统计学软件进行统计学处理，计量数据以均数±标准差(±s)表示，各蛋白的相对表达行成组t检验，临床病理因素间各蛋白的表达行成组t检验，各蛋白间表达的相关性用积差相关分析(persons相关检验)，ɑ=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 RUNX3、p21CIP1/WAF1、cyclinD1蛋白在肝癌及癌旁组织中的表达
Western Blot检测结果示，在43例所测组织标本中，RUNX3蛋白和p21CIP1/WAF1蛋白在肝癌组织中的相对表达值(0.3989±0.2072、0.4865±0.2269)均低于癌旁组织相对表达值(0.5358±0.1841，t＝-3.239，P＜0.05；0.5909±0.1874，t＝-2.325，P＜0.05）；cyclinD1蛋白在肝癌组织中的相对表达值(0.7275±0.2194)，高于癌旁组织相对表达值(0.2674±0.1769，t＝10.707，P＜0.001），见图1。
2.2 RUNX3、p21CIP1/WAF1、cyclinD1蛋白表达与肝癌临床病理因素的关系
RUNX3和p21CIP1/WAF1蛋白相对表达量与性别、年龄、HBsAg、AFP、肿瘤大小、静脉癌栓均无明显关系（P＞0.05），并均与TNM分期及组织分化程度有关，且随分化程度的减低和临床分期的加重而减低（均P＜0.05）；cyclinD1蛋白相对表达量与性别、年龄、HBsAg、AFP、肿瘤大小、静脉癌栓无明显关系（P＞0.05），与TNM分期及组织分化程度有关，且表达随分化程度的减低和临床分期的加重而升高（P＜0.05），见表1。表1 RUNX3、p21CIP1/WAF1、cyclinD1蛋白表达与其临床病理因素的关系(略)
2.3 肝癌组织中RUNX3蛋白表达与p21CIP1/WAF1及cyclinD1蛋白表达的关系
统计学分析表明，肝癌组织中RUNX3蛋白表达与p21CIP1/WAF1蛋白表达成正相关，r=0.696(R2=0.484，P＜0.05)；RUNX3蛋白表达与cyclinD1蛋白表达成负相关性，r=-0.435(R2=0.193，P＜0.05)；p21CIP1/WAF1蛋白表达与cyclinD1蛋白表达成负相关性，r=-0.328 (R2=0.108，P＜0.05)。
2期高锋利，等．RUNX3、p21CIP1/WAF1、cyclinD1在肝细胞性肝癌中的表达及其临床意义
3 讨论
RUNX3基因于1994年被发现，是runx家族中最小的转录因子，RUNX3位于染色体1p36［1］。RUNX3作为一个新发现的抑癌基因，能直接影响细胞生长周期，对细胞的信号转导和其它生物学效应也有着重要而复杂的转录调节作用。张海元等［5］采用DNA甲基化特异性PCR(MSP) 技术分别对5种肝癌细胞系和52 例肝细胞癌患者肿瘤组织及其癌旁组织RUNX3 基因启动子区域甲基化进行检测，认为RUNX3 基因启动子区域甲基化是导致RUNX3基因失活的主要原因之一，即启动子异常甲基化的癌组织标本中，往往同时伴有 RUNX3 基因表达缺失或下调，并与肝细胞癌发生密切相关。本实验结果显示，RUNX3蛋白在癌组织和癌旁组织中的表达差异有统计学意义，提示RUNX3的表达下调与HCC的发生关系密切，很可能作为肝癌的抑癌基因在肝癌的发生中起到重要作用。同时发现在不同的组织分级及肿瘤分期之间，癌组织中RUNX3蛋白表达差异也有统计学意义，RUNX3的表达随分化程度的降低和TNM的加重而降低，表明RUNX3的表达与HCC发展过程中的细胞分化增殖有关，RUNX3蛋白的表达减低水平对肝细胞癌的分化、侵袭及预后有参考价值。
研究发现，肝癌的发生与G1/S期检测点缺陷有关［6］。cyclins-CDKs-CKIs系统是细胞增殖周期的重要部分，在该系统中cyclinD1可激活CDK4，而p21CIP1/WAF1则可抑制CDK4的活性，cyclinD1和p21CIP1/WAF1蛋白分别是细胞周期调控G1/S期检测点的正性和负性调节因子中的重要成员。有研究认为RUNX3基因与TGF-β信号途径密切相关［7］，而p21CIP1/WAF1是TGF-β信号下游的靶基因，当Runx结合域突变时，p21启动子的活性明显降低，而当RUNX3和Smads协同表达时p21启动子被激活，从而使细胞对TGF-β信号反应增强［8］。陈金明等［9］在胃癌中的研究也表明，RUNX3蛋白可能通过影响p21蛋白的表达影响胃癌的发生发展。cyclinD1是细胞周期素家族(cyclins)中与肿瘤关系最为密切的成员，如果在G1期它的表达受抑制，将会阻碍细胞进入S 期［10］。而有研究显示恢复RUNX3表达可使cyclinD1表达下调，并且可抑制肿瘤细胞的生长［11］。上述研究表明：作为下游基因的cyclinD1和p21CIP1/WAF1可能与RUNX3基因关系密切。本研究中cyclinD1蛋白表达在肝癌组织中明显升高，而p21CIP1/WAF1蛋白表达在肝癌组织中明显降低，两者在癌组织和癌旁组织中表达的差异有统计学意义，说明cyclinD1蛋白表达上调及p21CIP1/WAF1蛋白表达下调与HCC的发生密切相关。p21CIP1/WAF1蛋白表达在癌组织不同组织分级及肿瘤分期间有差别，cyclinD1蛋白表达在癌组织中不同的组织分级、肿瘤分期及肿瘤大小间，其表达差异有统计学意义，提示cyclinD1及p21CIP1/WAF1蛋白表达与HCC发展过程中的细胞分化增殖及HCC进展有关系［12-13］，可能对肝癌预后判断有一定价值。RUNX3蛋白在肝癌组织中的表达与p21CIP1/WAF1蛋白表达呈正相关（r=0.696，P＜0.05），与cyclinD1蛋白表达成负相关性（r=-0.435，P＜0.05），p21CIP1/WAF1蛋白表达与cyclinD1蛋白表达成负相关性 (r=-0.328，P＜0.05)，说明了cyclinD1和p21CIP1/WAF1表达可能受RUNX3表达的影响，三者共同参与了细胞生长的负性调节作用，维持正常细胞周期。一方面，可能由于处在上游的RUNX3蛋白异常表达通过一系列连锁反应影响到下游的p21CIP1/WAF1蛋白，使p21CIP1/WAF1蛋白低表达及功能改变，而p21基因可能与cyclinD1基因等正性调节因子之间存在负反馈机制进一步使CDK4的负性调控子cyclinD1反应性过表达；另一方面，cyclinD1可能也是RUNX3的下游靶基因，RUNX3蛋白异常表达直接导致cyclinD1反应性过表达，最终可能造成细胞周期调控系统的平衡紊乱，但这还需要进一步验证。因此推测，通过对上游抑癌基因RUNX3的调控，有可能实现对下游基因p21CIP1/WAF1和cyclinD1的调控而影响细胞周期，进而抑制肝癌细胞的增殖，新抑癌基因RUNX3作为与TGF-β信号通路关系密切的上游靶基因很可能为HCC的基因治疗提供了新的靶点。
总之，HCC的发生、发展是多种基因联合作用的结果，由于癌基因与抑癌基因之间平衡的破坏导致细胞周期调控机制的紊乱是导致HCC发生的重要原因。RUNX3基因很可能通过其蛋白表达的改变引起细胞调控网络的连锁反应，直接或间接地影响到下游p21CIP1/WAF1及cyclinD1蛋白的表达及活性，从而促使了细胞周期调控系统的紊乱导致HCC发生。但关于RUNX3基因与p21CIP1/WAF1及cyclinD1基因间确切的作用机制，还需要进一步探索。
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