作者：崔岫，孙静，党玲，杨旭，孙苗
【摘要】 研究改良墨汁灌注法，使之适用于卵巢移植后新生血管的显示和观察。配制墨汁固定灌注液，小鼠卵巢肾被膜下移植后36h，麻醉状态下将墨汁灌注液通过左心室灌注固定小鼠，灌注后取材进行移植物与移植部位血管贯通的观察。结果，可见有贯穿肾组织至卵巢组织之间被墨汁填充的微血管，移植物内的卵泡及间质腺周围微血管中可见墨汁充盈或墨汁颗粒，灌注的成功率达到100%。表明甲醛墨汁灌注法可清晰地显示卵巢移植早期血流贯通的状态。
【关键词】 墨汁灌注；卵巢移植；血流贯通
随着组织工程技术和器官组织移植研究的深入进行，血管新生的研究已不再仅仅局限于肿瘤学。血管重建的实效性研究已成为组织修复、移植物与受体血流贯通及血管重建干预效果的有效检测指标之一［1］。微血管主要包括微动脉、微静脉和毛细血管等，通常是指管径小于300μm的血管，移植组织与受体组织血管贯通的初始阶段是微血管的形成。本文将以卵巢器官移植为对象，对小动物器官移植后的血管灌注方法的改良进行总结，旨在为小器官移植的血管贯通研究提供更好的显示方法。
1 材料与方法
1.1 墨汁灌注液的配制
中华牌墨汁（一得阁）∶PBS∶40%甲醛为4∶5∶1，灌注液中同时含0.5%肝素，配制好的墨汁固定液要经过滤。
1.2 实验动物
成年雌性昆明小鼠16只，体重20-24g，随即分为正常组和卵巢移植组，各组8只动物。适应性饲养1周后开始试验。
1.3 卵巢移植
卵巢的摘除及移植：0.5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠（0.03 mL/g），背卧位，常规消毒后，在肋脊角处切开皮肤及肌肉，在肾下级找到卵巢，自输卵管处结扎卵巢动静脉，完整切除双侧卵巢，将卵巢一分为二，在肾上级将肾被摸切用一小口，使用显微手术镊将半卵巢由肾被膜切口处移入肾脏下端，滴加培养液后，依次缝合手术切口。
1.4 正常对照组和卵巢肾被膜下移植36h后，采用腹腔注射0.5%戊巴比妥钠麻醉小鼠后，逐层打开胸腔，将注射器于心尖部插入左心室内，在1min内匀速注射1.5～1.8mL灌注液，同时右心耳开窗放血，注意观察小鼠的眼、耳、口腔黏膜、趾端及鼠尾。当它们均变黑时，表明墨汁到达了末梢血管，灌注成功。停止灌注约2min后取材，组织块在PBS液中冲洗2～3遍后置于4%多聚甲醛液固定24h、石蜡包埋。组织切片厚度在5μm以上，常规漂片、烘烤后HE染色，在显微镜(Olympus PM- 10AD)下观察血供建立情况并拍照。
2 结果
正常对照组结构完整的卵巢组织中血管显示清晰，尤其是围绕卵泡膜外层的微血管分布清晰，管腔内可见细小墨汁颗粒（图1，见封2）。卵巢移植组显示清晰的肾脏组织结果中血管系统灌注充分，肾小体轮廓分明，肾小管周围直小血管被切成不同断面。移植的卵巢组织紧邻肾皮质表面，结构清晰，可见有贯穿肾组织至卵巢组织之间被墨汁填充的微血管，移植物内墨汁也已充斥在移植卵巢的卵泡和间质腺周围的微血管中（图2，见封2）。灌注的成功率在这次组合卵巢移植组均达到100%。
3 讨论
在微血管的观察方法中，HE染色法是实验室最常用的方法。其方法简单快捷，技术容易掌握，但所显示的微血管均为断面，血管的连续性差，尤其是不具备观察移植物与受体部位血管贯通的状态。内皮细胞的免疫组化染色法是目前国内外最常用的方法之一，但苏木精复染可使细胞核着色，新生血管在无细胞核的部位所形成的血管管壁非常薄，故技术要求较高；除此之外，观察微血管的方法还有很多，如：树酯灌注扫描电镜观察、超薄切片透射电镜观察、微导管法及MRI等，其中微导管法和MRI可以进行微血管功能性的研究。但这些方法需要的设备和技术要求较高，广泛应用相对困难。
墨汁灌注后光镜下观察到的黑色线条，显示的为微血管内径，灌注的组织学切片不仅可显示微动脉、微静脉，还能很好地显示毛细血管，并可观察组织和微血管的结构。墨汁灌注后，不仅可显示微动脉、微静脉，还能很好地显示毛细血管，并可根据墨汁的痕迹观察血管的走行分布。当墨汁灌注与组织切片和HE染色技术相结合还可观察组织和微血管的结构［2］。
墨汁灌注是一种传统的观察血管分布的检测方法，大多数的灌注方法都要使用生理盐水快速灌流冲洗，再将固定液和墨汁灌注入血管［3］。这些方法将冲洗和固定及墨汁灌注分步骤进行，其优点可以充分扩张血管，墨汁充盈良好。但操作过程复杂，墨汁灌注液中配有明胶成分，需要在温热的条件下加压灌注［4］。为了观察促血管化因素对无血管吻合卵巢组织移植物血管化的影响，我们使用了墨汁灌注法，目的在于观察移植物与受体移植部位的血供重建时间。由于新生的血管建立在两种不同组织质地的器官之间，操作过程和灌注液的浓度均可影响结果的观察。本文所采用的方法是将固定液与墨汁混合，灌注前无需冲洗血管，而是借助于血管内的血液与一定量的墨汁固定液混合，将墨汁固着在血管内。灌注固定液内的甲醛达到4%，为常用10%的福尔马林，能够产生很好的固定作用。同时，无明胶的灌注液稀薄，可以通过较细小的微血管。待血管固定后，将标本制成切片。由于墨汁不与一般的化学试剂发生反应，灌注后可同时附加其它组织学制片技术。同时，经过滤的墨汁颗粒细小，可以进入微小的毛细血管，能更有效地显示血流贯通的行程，可用于新生血管走向和重建的研究。
实验结果表明，该方法操作简便、可信度高，费用低，其灌注过程基本能反映其生理性血液灌流过程。需要注意的是灌注速度不可太快，灌注量不能过大，否则墨汁溢出血管，污染周围组织影响观察，但灌注量太低将会影响微血管的充盈。
参考文献
［1］党玲，孙静，贺晓亮，等.小鼠卵巢器官不同部位移植的效果比较［J］.中国组织工程与临床康复，2009，13(18):3530-3534.
［2］张卫光，冯风之，夏家骝，等.几种微血管形态学观测方法间的比较分析［J］.中国临床解剖学杂志，2003，21（3）：408-410.
［3］李朗，孙俊，李明，等.加温灌注明胶墨汁制作动物脑血管模型的方法［J］.中国临床解剖学杂志，2004，2（2）：224.
［4］童建斌，曾乐平，陈 旦，等.明胶墨汁灌注展示大鼠视网膜血管的方法［J］.第三军医大学学报，2007，29（21）：2031-2037.