作者：丁淑琴， 王洁， 张焱， 王淑静， 朱佳佳， 张怡清
【摘要】 目的扩增结核分枝杆菌phoS2基因，并将其克隆至质粒pGEMT中进行核苷酸序列特性分析。 方法 以结核菌标准菌株H37Rv为模板，通过PCR技术扩增出结核分枝杆菌phoS2抗原基因，将其重组到pGEM-T载体后进行酶切鉴定及序列测定和生物信息学分析。结果 成功扩增出结核分枝杆菌phoS2抗原基因，测序表明该片段开放阅读框为927bp，与已发表基因核苷酸序列相比，同源性为81%，推导编码氨基酸序列同源性为87%。结论 成功克隆phoS2基因，为结核病原核表达及相关研究奠定了基础。
【关键词】 结核分枝杆菌;phoS2基因;克隆;序列分析
结核病系结核分枝杆菌感染引起的慢性疾病，为国内外面临的严重的公共卫生问题[1]。结核病严重危害人类的生命健康，在当今世界上每1秒钟就有1人新感染结核病，如不控制，今后10年，全球将有9000万人发病[2] 。快速、廉价、简单易用的诊断技术对于控制结核病发展和阻断其传播均有重要的意义。用免疫学方法检测结核病人血清中的特异性抗体是一种快速、简便的检查技术，在结核病的诊断中得到广泛的应用。寻找结核分枝杆菌特异性抗原是这项技术发展的关键，目前国内外研究人员主要采用基因工程的手段来获取单一特异抗原。phoS2(phosphate transport receptors，即pstS3)是一种暴露于膜表面的磷酸盐转运受体，国内外曾有报道用phoS2 裸抗原免疫小鼠后可以提高小鼠的抗结核感染能力[3-4]，但是尚未发现应用phoS2 抗原诊断结核病的报道。本研究拟通过分子生物学技术获得结核分枝杆菌phoS2基因序列，并对其进行序列分析，为其进一步原核表达及用于血清学诊断的研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒与菌种 标准菌株H37RvDNA由西安第四军医大学王丽梅博士友情馈赠，pGEM-T 连接载体购自Promega 公司。
1.1.2 酶与试剂 E.coli JM109感受态购自北京全式金生物技术公司，X-gal、IPTG、TaqDNA聚合酶购自Promega 公司，限制性内切酶EcoRI、XholI购自HIMERx公司，200bpDNA Marker、λDNA HindⅢ Marker购自北京华美公司，质粒提取试剂盒、DNA回收试剂盒购自天根生物工程公司。
1.1.3 PCR(聚合酶链反应)引物 通过互联网GeneBank 公共数据库检索出结核分枝杆菌phoS2基因序列(GeneID:885366)，分别在起始端和末端设计出一对引物。
P1: 5'-AGGAATTCATGACCCGCTTTGTCAACGTG-3'
P2: 5'-ATCTCGAGTCAGGCGATCGCGTTGACCG-3'
为了便于亚克隆，在引物1和引物2的两端分别引入了一个EcoRI和XholI酶切位点。引物由上海生物工程公司合成。
1.2 方法
1.2.1 PCR 其反应组成为：10×Buffer(含Mg2+)2.5μL， 10mmoldNTP 0.5μL，引物1和引物2各0.5μL，DNA 2μL，TaqDNA酶0.5μL，ddh3O 18.5μL。反应条件为： 94℃ 4min; 94℃ 30s， 60℃ 30s，72℃ 30s，30个循环;72℃ 7min。待反应结束后，将PCR产物在1.5%琼脂糖胶上电泳，观察结果。
1.2.2 PCR产物的纯化与目的基因的克隆 用DNA回收试剂盒对PCR产物切胶回收。DNA与pGEM-T载体在T4连接酶的作用下，4℃连接过夜。连接产物转化入E.coli JM109感受态细胞，将其涂布于预先铺有(1M)IPTG和X-gal的YT平板上，37℃培养过夜。
1.2.3 重组质粒的酶切鉴定 经蓝白斑筛选，挑选白色菌落，碱裂解法提取质粒，用EcoRI、XholI酶切后经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.2.4 DNA序列测定及特性分析 扩增片段重组质粒的序列由上海生物工程公司进行。将测序结果在NCBI/GeneBank数据库进行BLAST比较和分析。
2 结果
2.1 phoS2基因的PCR扩增 PCR成功扩增出特异性DNA片段，位于1000bp左右，与预期结果一致(见图1)。
1. PCR products of phoS2; 2. DNA Marker
图1 phoS2目的基因的扩增
2.2 phoS2/ pGEM-T/JM109重组质粒的构建及鉴定 PCR产物与pGEM-T载体连接，构建了扩增片段/ pGEM-T/JM109重组克隆体系。经酶切鉴定，得到了大约1000bp的DNA片段(见图2)。
1. phoS2/ pGEM-T digested by EcoRI and XholI;
2. PCR products of PhoS2; 3. phoS2/ pGEM-T plasmid;
4. pGEM-T plasmid; 5. 200bp DNA Marker;
6. λDNA HindⅢ Marker
图2 阳性重组质粒的酶切鉴定
2.3 phoS2序列测定及同源性比对分析 从正反两个方向对插入片段进行测序，双向测序的结果相吻合。测序结果显示phoS2目的片段完整开放阅读框由927bp组成。将序列与GenBank中已发表的基因核酸序列进行比较，同源性最高达81%(GenBank序列号：dbj|DD369588.1|)，见图3。与GenBank中已发表的基因氨基酸序列(GenBank序列号：gb|AAQ43058.1|)进行比较，同源性达87%(见图4)。
3 讨论
早期准确诊断结核病对控制结核疫情至关重要。目前对结核病的实验诊断主要依据细菌学检查和血清学检测。细菌学检查虽然是结核病确诊的金标准，但培养周期长，繁琐费时，影响因素多，不能作为快速诊断方法;血清学检测虽是一种简便快捷的实验诊断方法，但由于抗原的质量问题常会影响检测的特异性和准确性，所以结核病血清学诊断的关键是寻找有效特异的抗原成分。基因重组技术的应用为这一关键环节的研究带来新的希望。
目前，关于phoS2 基因的研究国内外文献报道较少。该基因编码370 aa，长度1110 bp，相对分子质量为37953 Da。其功能涉及无机磷酸盐通过细胞膜的主动运输，是结合蛋白介导的磷酸盐转运的一种必需蛋白，它对于诱导机体抗结核分枝杆菌的保护性免疫反应非常重要[5-6]。当前，人们对结核杆菌38 kDa 蛋白的研究非常热衷，各种报道很多。通常所指的38 kDa 蛋白质的编码基因为Rv0934，长度为1122 bp， 含374 aa，是一种被各独立实验研究最深入的蛋白质，虽然其分子量与我们研究的phoS2 蛋白十分相近，但与之完全不同。国外曾先后报道用phoS2 作为疫苗接种C57BL/ 6小鼠可以明显保护小鼠不受结核分枝杆菌的感染[5-6]，国内顾田园等人用phoS2 免疫小鼠，3 次免疫后经静脉结核菌强毒株攻击，鼠的肺脏和脾脏的载菌数均比阴性对照少，表明它能诱导机体产生细胞免疫和体液免疫应答[7]。但是尚未发现其在结核病诊断方面的相关研究。
鉴于结核分枝杆菌疫苗研究中发现的phoS2所具有的重要价值，本研究通过Internet检索到GeneBank 发表的结核分枝杆菌phoS2序列，应用PCR方法扩增出该基因片段，并成功构建phoS2/pGEM-T/JM109克隆体系。实验同时在基因片段的上下游引物上分别设计了EcoRI和XholI酶切位点，为后续的基因重组及序列的鉴定提供了保证。克隆基因提纯后经酶切及测序鉴定证明与预期结果一致。基于进化学说理论基础上的序列比对，认为如果两个序列间有足够的相似性，则它们可能来源于共同的进化祖先，也可能是同源的。通常认为，蛋白质空间结构及其功能较核酸一级结构序列具有更大的保守性，因此一般来讲，如果蛋白质序列间的相似性大于30%，它们很可能是同源的。[8]通过蛋白质同源性检索发现，本研究克隆基因与GeneBank报道核酸基因序列有81%同源性，氨基酸序列同源性达87%。该基因片段的获得为下一步表达载体构建、蛋白表达、纯化及血清学诊断价值的研究工作奠定基础。
参考文献
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